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ITS2序列鉴定“功劳叶”药材及其近缘混伪品＊
目的：中药材同名异物现象对临床安全用药造成了潜在的威胁。本研究对两种“功劳叶”药材及其近缘混伪品进行分子鉴定，以确保临床准确用药。方法：本实验收集枸骨、阔叶十大功劳和细叶十大功劳及其近缘混伪品共9个物种45份实验样品，用改良的CTAB法提取总DNA ，扩增ITS2序列并双向测序，采用CondonCode Aligner V 4.2.4对测序峰图进行拼接，应用MEGA 6.0进行序列变异分析，计算种内种间Kimura 2-Parameter（K2P）遗传距离，构建系统邻接（NJ）树。结果：基于ITS2序列的序列变异、近距离法和系统邻接树分析结果均表明，冬青属枸骨以及十大功劳属阔叶十大功劳和细叶十大功劳均能与其混伪品很好地区分开。结论：ITS2序列可有效区分两种“功劳叶”药材及其近缘混伪品，为临床准确用药提供依据。
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基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物
本研究对川贝母5种不同基原植物ITS2序列进行PCR扩增和测序；同时扩大研究范围,从GenBank上下栽川贝母及其常见混伪品共10个物种13个样本的ITS2序列.用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,后利用ITS2序列重构其系统发育树.结果显示川贝母基原植物种内大K-2-P距离为0.0276,与混伪品的种间小K-2-P距离为0.0583:川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异；重构的系统发育树显示川贝母不同基原物种聚为一支,能较好与混伪品区分.研究结果表明ITS2条形码序列能够成功鉴定川贝母及其混伪品的原植物,为川贝母混伪鉴别提供了新工具.
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高良姜及其混淆品的分子鉴定
目的:探讨基于ITS2条形码序列鉴定高良姜及其混淆品的新方法.方法:本研究对高良姜及其混淆品6个物种9份样品的ITS2序列进行PCR扩增和测序,同时扩大研究范围从GenBank上下载同属共15个物种37个样本.用MEGA4.1计算其种间、种内的K2P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,后利用ITS2序列重构其系统发育树.结果:高良姜基源植物种内大K2P距离为0.0171,与混伪品的种间小K2P距离为0.0469;高良姜及其混淆品的ITS2二级结构存在明显差异;重构的系统发育树显示高良姜的不同来源聚在一支,能较好与混淆品区分.结论:ITS2序列能够成功鉴定高良姜及其易混淆品,可以作为高良姜及其混淆品的分子鉴定工具.
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耳草属岭南药材DNA分子鉴定研究
目的:本研究应用ITS2序列作为DNA条形码对9种广东耳草属药材进行鉴定研究.方法:收集广东耳草属药材样本,通过植物基因组DNA提取、PCR扩增以及产物的双向测序获得ITS2序列,所得序列采用CodonCode Aligner进行拼接.用MEGA 6.06进行比对,分析种内和种间遗传距离,并构建系统进化树.结果:9种耳草属植物65条序列长度范围为208-224 bp,共有92个碱基变异位点,种内遗传距离(0.002)明显小于种间遗传距离(0.202).NJ和ML聚类树结果基本一致,除耳草与金毛耳草关系较近难以区分外,其余7个物种种内样本分别聚在一支,表现出单系性.结论:ITS2序列基本能够准确的鉴定广东耳草属药材,可作为耳草属药材基原植物鉴定的候选条形码序列.
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基于DNA条形码的岭南特色药材广东海桐皮、木棉花与其混淆品的分子鉴定
目的:本研究主要应用第二内转录间隔区(ITS2)序列作为DNA条形码进行分析,建立对岭南中药广东海桐皮、木棉花与其混淆品的快速鉴定法.方法:收集广东海桐皮等9个物种样本,提取样本基因组DNA,扩增ITS2基因片段,对其产物进行双向测序.所得序列采用CodonCode Aligner进行拼接.利用MEGA 6.06软件进行种间变异及遗传距离分析,并构建系统进化树.结果:9个物种的ITS2序列长度范围为224-237 bp,物种的种内遗传距离(0.000-0.017)明显小于种间遗传距离(0.045-0.820),NJ和ML聚类树显示,各物种样本独聚一支,表现出单系性.结论:ITS2序列能够有效鉴别植物海桐皮、木棉花与其混淆品,为其基原植物鉴定提供依据,为保证用药真实及其临床疗效提供分子鉴定方法.
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应用ITS2条形码鉴定岭南药材余甘子及其混淆中药品种
目的:本研究应用ITS2序列作为DNA条形码,建立余甘子及其混淆品分子鉴定方法.方法:收集8种共17份余甘子及其混淆品植物样本,提取基因组DNA,扩增ITS2基因并双向测序.所得序列采用Codon Code Aligner进行拼接,同时,从GenBank数据库中获3条相关ITS2序列用于比较分析.利用MEGA 6.06软件分析其种内及种间遗传距离,并构建系统进化树.结果:余甘子ITS2序列长度为208 bp,与其他各物种种间变异位点较多,遗传距离较大,为0.174-0.823.聚类树结果显示,余甘子基原植物独聚一支,与其他混淆品能够容易区分.结论:本研究采用ITS2序列能够有效鉴别余甘子及其混淆品基原植物,可为保证临床用药真实安全提供技术支撑.
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峨眉山区桑科药用植物ITS2条形码序列鉴定
目的:评价以ITS2序列作为DNA条形码对峨眉山区桑科药用植物的鉴定作用.方法:于四川峨眉山地区采集桑科药用植物样本25个,提取DNA,对其ITS2序列进行PCR扩增并测序,从GenBank上下载23条同科ITS2序列;运用MEGA6.0对所有序列种间种内遗传距离进行计算分析,构建Neighbor Joining (NJ)系统进化树;利用TAXON DNA软件分析所有序列种内、种间变异并作barcoding gap分析;从ITS2数据库中预测并比较样本ITS2序列的二级结构差异.结果:桑科样本种间K2P小遗传距离(0.041)大于种内大距离(0.005),并有较为明显的barcoding gap;NJ树显示种各属样本分别聚为一大枝,种内之间于各属分支中各聚为一支;各属及各种样品ITS2二级结构存在明显差异.结论:以ITS2序列作为DNA条形码,能够对桑植物进行准确、快速的识别和鉴定,准确地弄清物种之间的系统进化关系,为峨眉山区该属药用植物的分布、种群及种群量研究提供指导,对其质量控制、安全用药及资源保护及合理开发利用提供理论依据.
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ITS2序列鉴定大蓟、小蓟药材及其近缘混伪品
目的:应用ITS2序列鉴别大蓟、小蓟药材及其近缘混伪品,以保障临床用药准确.方法:收集大蓟、小蓟药材的基原物种蓟和刺儿菜及其近缘混伪品,经DNA提取、PCR扩增、测序和序列拼接等步骤,获得ITS2序列,结合GenBank载序列共14个物种54条序列,用MEGA6.0对序列进行比对分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-Parameter)遗传距离,构建系统邻接(NJ)树.结果:ITS2序列分析表明,蓟和刺儿菜种内变异位点数均远小于其与混伪品种间变异位点,以上2个物种种内大(平均)K2P距离均小于其与混伪品种间小(平均)K2P距离;基于ITS2序列的系统NJ树可以将蓟和刺儿菜及其近缘混伪品很好地区分开,且各物种均单独成支.结论:ITS2序列可以很好地鉴定大蓟、小蓟药材及其近缘混伪品.
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种子类药材补骨脂及其混伪品的ITS2条形码序列鉴定
目的:种子类药材补骨脂具有肝肾毒性,其混伪品曼陀罗子、天仙子、洋金花的种子、猪屎豆也含有毒性成分,且补骨脂与其混伪品外形相似,易导致混用误用,严重危害人体健康.本研究利用DNA条形码技术,分析补骨脂及其混伪品的ITS2序列,以期快速准确鉴定补骨脂及其混伪品,保证其用药安全及临床疗效.方法:对补骨脂及其混伪品样品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列,并进行双向测序,所有序列用MEGA6.0软件进行种间、种内Kimura2-parameter (K2P)遗传距离计算,并构建NJ系统聚类树.结果:补骨脂ITS2序列长度为233bp,G+C含量为69.5％,种内无变异位点.补骨脂与其混伪品种间变异位点较多,种间K2P小距离为0.5321,远远大于其种内距离,NJ树显示可以将补骨脂及其混伪品完全分开.结论:ITS2条形码序列可准确鉴别种子类药材补骨脂及其混伪品,为保证补骨脂的临床用药安全和种质资源鉴定提供了良好的技术手段.
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辽宁省白头翁属植物分类与基于ITS2的DNA条形码分子鉴定
目的:进一步总结辽宁省白头翁属植物种类,为合理开发保护白头翁属植物资源提供依据.方法:从植物形态、花粉粒、基于内转录间隔区(ITS2)序列的DNA条形码分子鉴定三方面对辽宁省白头翁属植物进行分类与鉴定研究.结果:在全国第四次中药资源普查中,笔者经实地调查白头翁属植物的形态特征、花粉粒微观形态、基于ITS2序列的DNA条形码分子鉴定等,确证了一新种白头翁-岩生白头翁(Pulsatilla saxatilis)的存在;确证了兴安白头翁(P.dahurica),白花白头翁(P.chinensis)两种辽宁省新记录;确证了在大连市大黑山、鞍山市千山有金县白头翁(P.chinensis var.kissii)的存在.结论:辽宁地区为白头翁的主产区之一,白头翁药材基本都为野生,价格逐年上涨,加之开荒种地等原因,辽宁地区白头翁属资源正在逐年锐减,更加造成了白头翁属植物资源的匮乏,急需加快栽培技术研究,保护白头翁属植物野生资源的多样性和保证白头翁药材的可持续利用.
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坚龙胆主要次生代谢产物及分子差异的研究
目的:通过含量测定与DNA条形码分析,探讨坚龙胆主要次生代谢产物及分子的差异.方法:采用HPLC测定不同居群坚龙胆根及根茎、茎、叶、花中主要次生代谢产物龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷及苦龙胆酯苷含量,建立其指纹图谱共有模式,用单因素方差分析对主要次生代谢产物间的差异进行评价;并采用DNA条形码技术对不同居群坚龙胆样品进行ITS2测序.结果:不同居群坚龙胆根及根茎、茎、叶、花中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷及苦龙胆酯苷含量具有极显著差异(P＜0.01);同时ITS2序列结果显示不同居群坚龙胆分子差异较小.结论:不同居群坚龙胆主要次生代谢产物有一定差异,但分子间差异较小,亲缘关系较近.
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基于ITS2序列的吴茱萸属植物亲缘关系及分子鉴别研究
目的:研究吴茱萸药材3种不同基原植物及伪品楝叶吴茱萸的亲缘关系和真伪鉴别.方法:采用DNA条形码技术,对ITS2区段进行PCR扩增和测序,使用MEGA 5.1软件计算种内、种间Kimura-2-parameter遗传距离,采用邻接(NJ)法构建其系统发育树.使用DNAstar 5.0软件比对特异性位点.结果:4个物种共18个样本的ITS2序列长度均为220bp,产生了17个单核苷酸多态性位点,其中特异性位点7个;正品吴茱萸药材的3种基原植物种内大遗传距离为0.023,种间遗传距离为0.036-0.039,与楝叶吴茱萸的小种间遗传距离为0.042; NJ系统发育树表明:基于ITS2序列聚类的吴茱萸基原植物可与楝叶吴茱萸有效区分,3种基原植物同一品种样本优先聚类,其次是同一产区聚类.结论:ITS2 DNA条形码可以准确有效地用于吴茱萸属植物亲缘关系研究和真伪品的鉴别.
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黄花紫堇、多刺绿绒蒿及其同属近缘物种的ITS2条形码鉴定与分析
运用ITS2 DNA条形码技术鉴定中药材黄花紫堇、多刺绿绒蒿及其近缘物种,以保证药材质量,确保用药安全.文中对采自西藏拉萨的黄花紫堇、多刺绿绒蒿等13个药材样品进行了DNA提取、PCR扩增和测序;对实验序列和GenBank下载的71条切除两端的5.8S,28S区域,使用MEGA 5.0进行多重序列比对,并进行种内、种间遗传距离计算和进化树构建;同时预测了黄花紫堇、多刺绿绒蒿与其近缘种ITS2序列的二级结构.结果表明,作为DNA条形码,ITS2序列能够有效地对黄花紫堇、多刺绿绒蒿及其同属近缘物种进行分子鉴定.该研究不仅可为黄花紫堇、多刺绿绒蒿及其近缘物种、相关混伪品建立基于.ITS2序列的DNA条形码的规范和安全的检测技术及鉴别方法,也为其质量控制、安全用药及合理开发利用提供理论依据及数据支撑.
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木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定
通过分析木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材的ITS2(internal transcribed spacer 2)条形码序列,探讨木香类药材鉴定新方法.对60份样品提取基因组DNA,PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,采用MEGA5.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离(K2P),构建邻接树(neighbor-joing tree,NJ Tree).结果表明,无论是菊科的木香、川木香、土木香,还是马兜铃科的青木香和五味子科的红木香,ITS2序列种内变异均小于种间变异,ITS2序列所有单倍型比对后长度为272 bp,变异位点达到162个;遗传距离显示物种种内平均K2P远远小于种间平均K2P;NJ树结果显示木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材可明显区分,且能鉴别川木香的2个基原物种.因此,ITS2序列可用于鉴定木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材,为临床安全用药提供依据.
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龙胆科藏药“蒂达”类的DNA条形码鉴定研究
应用1TS2序列对多基原龙胆科藏药“蒂达”进行DNA条形码鉴定,为保障该类药材的准确鉴定及其临床用药安全提供科学依据.以青藏高原地区龙胆科中獐牙菜属Swertia、花锚属Halenia、扁蕾属Gentianopsis、喉毛花属Comastoma、肋柱花属Lomatogonium5个属,共计13个种,151份实验样本为研究对象,提取“蒂达”药材的基因组DNA、扩增ITS2序列并双向测序.采用CodonCode Aligner V3.7.1对测序峰图进行校对拼接.ITS2序列经比对后长度为231 bp,13个种共31种单倍型,G+C平均含量达61.40％.小距离法和NJ树结果显示,龙胆科藏药“蒂达”类1 1个种能够各自聚为一支相互区分,并表现出良好的单系性,二叶獐牙菜和华北獐牙菜不能准确鉴定.ITS2序列可准确、稳定的鉴别龙胆科藏药“蒂达”类药材,从而为进一步构建复杂多基原藏药品种真伪鉴别方法提供了科学参考.
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火炭母药材的DNA条形码分子鉴定研究
目的通过ITS2序列鉴别火炭母药材及其混伪品.方法试剂盒法提取火炭母药材基因组DNA,PCR扩增其ITS2序列,MEGA6.0软件分析供试材料序列的变异位点,计算其种内种间K2P遗传距离,构建NJ系统聚类树.结果 火炭母药材种内变异小,与其混伪品ITS2序列的二级结构差异显著,系统聚类树可明显区分火炭母药材及其混伪品.结论ITS2条形码可用于火炭母药材及其常见混伪品的鉴别,丰富了火炭母药材鉴定的技术方法,确定了火炭母药材的标准DNA条形码序列,对火炭母药材的准确鉴定和临床用药安全奠定了基础.
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ITS2序列鉴定多基原药材老鹳草
目的 应用ITS2序列检测市场收集的多基原药材老鹳草,为规范药材市场管理提供分子依据.方法 收集多基原药材老鹳草的基原物种栊牛儿苗、老鹳草和野老鹳草及其近缘混伪品,通过实验获取其ITS2序列,结合GenBank下载的序列共计28个物种82条序列,进行序列比对验证、近距离法和系统邻接(NJ)树分析,建立基于ITS2序列的老鹳草药材DNA条形码鉴定技术方法;运用该方法检测市场随机收集的18份老鹳草药材样品,经序列比对结合以上方法建立的系统邻接(NJ)树确定其物种基原,以判定其市场真伪.结果 ITS2序列能将老鹳草药材的3个基原物种及其近缘混伪品很好地区分开;18份市场收集的老鹳草药材ITS2序列鉴定结果表明,其中16份为正品,2份为混伪品.结论 该研究建立了基于ITS2序列的多基原药材老鹳草DNA条形码鉴定技术方法,实现了对市场随机收集的老鹳草药材物种基原的真伪判定,为多基原药材鉴定难题提供了参考方法.
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凉茶药材凉粉草与混伪品的ITS2条形码鉴定
目的 建立一种准确、快速的凉茶药材凉粉草与其混伪品的DNA条形码鉴定方法.方法 本实验收集凉粉草及其混伪品共5个物种和4个变种的55份样本,提取基因组总DNA,通过PCR扩增和CodonCode Aligner软件拼接注释获得完整的ITS2序列,然后应用种内种间K2P遗传距离和系统进化NJ树分析进行物种鉴定.结果 凉粉草ITS2序列长度为232 bp,种内遗传距离为0,远小于其与混伪物种间的小遗传距离0.210 2～0.310 9;NJ树结果表明,凉粉草独成一支,与其混伪品均可准确区分.结论 基于ITS2序列的DNA条形码技术能够准确有效地实现凉粉草与其混伪品的快速鉴别,保障凉茶药材凉粉草的使用安全.
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基于DNA条形码(ITS2)的绞股蓝与其混伪品的分子鉴定方法分析
目的 探讨基于ITS2序列的绞股蓝与其混伪品鉴定的新方法.方法 从GenBank中下载绞股蓝及其混伪品的TTS2序列,用软件MEGA4.0等进行相关数据分析,通过ITS2数据库预测ITS2二级结构,并用大简约法构建系统发育树.结果 绞股蓝与其混伪品的TTS2序列存在差异,其二级结构在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异,绞股蓝大种内K2P遗传距离远远小于其与混伪品的小种间K2P遗传距离,构建的系统发育树显示绞股蓝与其混伪品可明显分开.结论 基于DNA条形码的ITS2序列为绞股蓝及其混伪品的准确、简便鉴定提供了新的分子鉴定方法.
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大黄与易混伪品土大黄、虎杖原植物的ITS2序列鉴定
目的：研究比较大黄与易混伪品植物rDNA中ITS2碱基序列，寻找大黄及其混伪品的鉴别方法。方法对待测植物DNA的ITS2区进行PCR扩增及测序，计算大黄种内及其与混伪品的种间K2P距离，并构建NJ树。结果大黄与其易混伪品的小种间K2P距离为38.7%，显著大于其大种内K2P距离7.9%，NJ树中大黄不同来源的三个基原植物终聚为一支。结论ITS2序列对于大黄与易混伪品土大黄、虎杖的鉴定有重要价值，DNA条形码技术具有极大的应用前景，可作为传统中药鉴别的方法。
