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益心解毒方对气虚血瘀证心衰大鼠心肌组织中血小板-内皮细胞黏附分子和血管内皮生长因子表达的影响研究
目的：从血管新生的角度，探讨益心解毒方对气虚血瘀证心衰大鼠心肌保护的作用机制。方法利用左冠状动脉结扎术制备大鼠心梗后心衰动物模型，通过宏观表征判定该疾病模型的证候属性，将成模后存活大鼠随机分为8组：假手术组，模型组，益心解毒方高、中、低剂量组，中西结合组，福辛普利组和芪苈强心组。治疗4周后取梗死边缘区组织进行Western Blot及RT-PCR法检测血小板—内皮细胞黏附分子(又称CD31)和血管内皮生长因子的表达。结果 Western Blot结果显示：模型组大鼠心肌组织中CD31蛋白表达量较假手术组显著下降( P=0．004)，而高剂量组(P=0．042)、低剂量组(P=0.027)和芪苈强心组(P=0.015)与模型组相比均可提高心肌组织中CD31的表达。 PCR结果显示：与假手术组相比，大鼠心肌组织的血管内皮生长因子表达在模型组(P=0．047)，高剂量(P=0.023)，中西结合组(P=0．008)均显著升高；而低剂量组大鼠心肌组织中血管内皮生长因子的表达显著低于模型组(P=0.004)和其它治疗组(P<0.05)。结论益心解毒方对心梗所致气虚血瘀证心衰大鼠的心肌保护作用，可能是通过促进血管新生实现的，其机制可能与血管内皮生长因子有关，且具有剂量相关性。
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益心解毒方对AngⅡ诱导的H9c2细胞NADPH氧化酶表达作用机制的研究
目的:采用H9c2心肌细胞系,研究益心解毒方含药血清抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞Nox2、Nox4型NADPH氧化酶表达的影响.方法:取对数生长期的H9c2心肌细胞,同步化后进行实验,实验分为正常组、模型组、益心解毒方组、二亚苯基碘(DPI)对照组.采用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定H9c2心肌细胞内活性氧(ROS)水平;RT-PCR法和Western-blot法测定Nox2亚基和Nox4亚基的表达量.结果:研究发现,与模型组比较,益心解毒方含药血清能抑制ROS和Nox2、Nox4亚基表达的增高,其中益心解毒方低剂量组作用为显著(P＜0.01,P＜0.05).结论:结合课题组前期的动物实验研究表明,益心解毒方在改善心功能、减缓心室重构等方面药效显著,而抑制NADPH氧化酶活性,降低心肌ROS水平可能是其发挥药效的重要机制.
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益心解毒方对气虚血瘀证心力衰竭大鼠心肌组织中NOX2和NOX4的影响
目的:从氧化应激角度探讨益心解毒方(YXJDF)对气虚血瘀证心力衰竭大鼠心肌保护的作用机制.方法:120只SPF级雌性SD大鼠按体质量分为手术组(110只)和假手术组(10只),手术组利用左冠状动脉结扎术制备大鼠心力衰竭模型,将成模后存活大鼠随机分为7组:模型组,YXJDF高、中、低剂量组,中西结合组,福辛普利组和芪苈强心组,每组10只.治疗4周后取梗死边缘区组织进行western blot及RT-PCR法检测NOX4及NOX2的表达.结果:Western blot示与假手术组相比,模型组的NOX2和NOX4的表达均明显升高(P＜0.01);与模型组相比,YXJDF中剂量组可显著下调心力衰竭大鼠心肌组织中NOX2(P＜0.01)及NOX4(P＜0.05)的蛋白表达,较其它各治疗组更有优势;RT-PCR结果显示各治疗组均可明显下调心力衰竭大鼠心肌组织中NOX4的表达(P＜0.01,P＜0.05),以低剂量组下降多.结论:YXJDF对气虚血瘀证心力衰竭大鼠的心肌保护作用,可能是通过其对损伤心肌组织内氧化应激的调控实现的.
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益心解毒方对心梗后心衰大鼠心肌保护作用的实验研究
目的:探讨益心解毒方对心梗后心衰大鼠损伤心肌的保护作用机制.方法:利用左冠状动脉结扎术制备大鼠心梗后心衰动物模型,通过宏观表征结合理化指标综合判定该疾病模型的证候属性,并给予对证中药的干预.检测各组大鼠的心脏超声指标；通过血生化的方法检测血清中肌酸激酶(CK)的水平以及利用酶联免疫的方法测定血清中肌钙蛋白I(CTNI)的水平；并通过放免的方法检测血浆中内皮素(ET)与降钙素基因相关肽(CGRP)的浓度.结果:术后21d,模型组大鼠的心功能显著下降,主要表现在左室舒张末内径(LVEDd)、左室收缩末内径(LVEDs)明显增大,短轴缩短率(FS)以及射血分数(EF)急剧下降(P＜0.01)；血清中CK、CTNI水平显著升高(p＜0.01)；血浆中ET水平升高(P＜0.01),CGRP水平下降(P＜0 01).给予益心解毒方干预后,能够有效的降低心衰大鼠扩张的LVEDd和LVEDs(分别下降19％和25％,P＜0.05和P＜0.01),尤以改善LVEDs为主(P＜001),提高EF(提高25％,P＜0.01)；并且降低心衰大鼠血浆中上升的ET浓度(P＜0.05),升高血浆中CGRP浓度(P＜0.01),且进一步降低E T/CGRP的比值(P＜0.01)；显著下调心衰大鼠的血清中CK、CTNI(P＜0.01,P＜0.05).结论:益心解毒方能够有效的提高心衰大鼠的心功能,其机制与降低血中ET、CK、CTNI,并升高血中的CGRP水平等心肌保护作用有关.
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益心解毒方对Ameroid缩窄环致气虚血瘀小型猪证候表征的影响
目的:评价益心解毒方对Ameroid缩窄环致心功能不全小型猪气虚血瘀证表征的影响.方法:巴马小型猪22只,采用左冠状动脉前降支放置缩窄环的方式制备小型猪慢性心肌缺血心功能不全模型,按随机数字表法分为模型组、地高辛组、益心解毒方组,每组6只,另制备假手术动物4只.于术后第4周开始分别给予口服地高辛和益心解毒方,持续8周.于给药后第2、4、8周末,从动物一般状态,舌、鼻盘、足底色度改变等方面对动物气虚血瘀证表征进行评价.结果:给药前,模型组、地高辛组、益心解毒方组动物证候积分显著升高,舌、鼻盘、前蹄色度与假手术组比较改变显著(P＜0.05或P＜0.01);给药后4周及8周,益心解毒方组与模型组比较,多项指标显著改善(P ＜0.05或P＜0.01).结论:益心解毒方能够显著改善Ameroid缩窄环致心功能不全小型猪气虚血瘀证表征.
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益心解毒方对Ameroid缩窄环致心功能不全小型猪血液流变学的影响
目的 观察益心解毒方对Ameroid缩窄环致心功能不全小型猪血液流变学的影响.方法 巴马小型猪32只,采用左冠状动脉前降支放置缩窄环的方式制备小型猪慢性心肌缺血心功能不全模型,随机分为模型组、芪参益气滴丸组、益心解毒方组,每组6只,另制备假手术动物4只.测定全血黏度、还原黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞变形指数和红细胞聚集指数.结果 给药前,模型组、芪参益气滴丸组、益心解毒方组全血黏度1/5与假手术组比较均显著升高(P＜0.01或P＜0.05).给药后2周、4周、8周,模型组全血黏度1/150、1/10、1/5,还原黏度1/38、1/10、1/5,红细胞压积、聚集指数和变形指数与假手术组相比均显著升高(P ＜0.01或P＜0.05).各时间点2治疗组异常指标数量明显减少,给药后2周、4周还原黏度1/38和给药后8周红细胞压积值与模型组比较均显著降低(P＜0.01或P＜0.05).益心解毒方组给药后8周各项指标与假手术组比较无显著差异.结论 益心解毒方能够显著改善Ameroid缩窄环致心肌缺血心功能不全小型猪的血液流变学指标.
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益心解毒方抑制H9C2心肌细胞凋亡的作用机制
目的 研究益心解毒方对H9C2心肌细胞凋亡的抑制作用及可能机制.方法 实验分为正常组、模型组、益心解毒方组和槲皮素组,采用缺氧缺糖/复氧复糖诱导H9C2心肌细胞凋亡,研究益心解毒方的保护作用.运用CCK-8法检测细胞存活率,镜下观察细胞的形态改变,Fluo-3AM荧光染色法检测细胞内钙超载,Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡的情况,实时荧光定量PCR检测Fas和FasL的基因表达,Western Blot 测定p-Akt和caspase-8蛋白的表达.结果 与正常组比较,模型组细胞存活率显著下降,细胞皱缩变形,细胞发生钙超载,凋亡细胞增多,Fas和FasL的mRNA表达增加,caspase-8蛋白表达升高,p-Akt表达降低,均有统计学差异(P<0.05).与模型组比较,益心解毒方组细胞存活率增加,细胞形态有改善,细胞钙超载减轻,凋亡细胞的数量减少,p-Akt蛋白的表达上调,FasL mRNA和caspase-8蛋白的表达下调,均有统计学差异(P<0.05).结论益心解毒方能抑制H9C2心肌细胞凋亡,其作用机制可能与减轻钙超载和调控外源性凋亡途径相关.
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益心解毒方对Nox2和Nox4亚基过表达的心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响
目的：通过观察益心解毒方含药血清对Nox2、Nox4亚基过表达的H9 c2心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响，揭示其作用环节是否与干预相应亚型的 NADPH 氧化酶调控环节有关。方法采用PCR方法扩增Nox2、Nox4基因全长序列，经双酶切、连接载体和转化后提取重组质粒，经酶切鉴定的阳性质粒进行DNA测序，测序正确后按照lipofectamine 2000试剂的说明书瞬时转染H9 c2细胞，转染后的心肌细胞分组给予不同的药物干预，24 h 后检测 NADPH 氧化酶活性。结果①含有Nox2／Nox4亚基的重组质粒载体通过测序鉴定，结果与GenBank报道的完全一致。②通过荧光显微镜下观察转染72 h后的H9 c2细胞，可见大量发绿色荧光的细胞，流式细胞术计数结果显示转染率均在60％左右，符合实验要求。③空质粒载体组、模型组、益心解毒方组的NAD－PH氧化酶活性表达明显高于正常组（ P＜0．01，P＜0．05）；模型组和益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达高于空载体组（ P＜0．01）；模型组NADPH氧化酶活性表达均明显高于其他各组，而益心解毒方各组的NADPH氧化酶活性表达均明显低于模型组（ P＜0．01， P＜0．05）。结论成功构建大鼠心肌细胞Nox2、Nox4亚基的重组质粒载体，该重组质粒载体可以在心肌细胞中过表达，益心解毒方可以有效地降低NADPH氧化酶活性的表达。提示此复方治疗心衰的机制可能是抑制了Nox2和Nox4型NADPH氧化酶的表达。
关键词： 益心解毒方 H9C2心肌细胞 过表达 NADPH 氧化酶活性 -
益心解毒方对 NOX2亚基和 NOX4亚基过表达及小干扰 RNA 引起的心肌细胞还原型辅酶Ⅱ氧化酶活性变化的机制研究
目的：观察益心解毒方含药血清对NOX2、 NOX4亚基过表达和小干扰RNA （ RNAi）导致的H9C2心肌细胞还原型辅酶Ⅱ（ NADPH ）氧化酶活性的变化，探讨益心解毒方的作用机制。方法采用正常雄性Sprague－Dawley大鼠16只，构建针对NOX2、 NOX4亚基的过表达质粒和RNAi质粒。采用转染试剂瞬时转染H9C2心肌细胞，流式细胞术检测转染率，转染24 h后分组（正常H9C2细胞组、过表达组、 H9C2转阴性对照质粒组、 RNAi质粒组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方中剂量组、益心解毒方低剂量组）给予不同剂量的含药血清干预，24 h后检测NADPH氧化酶活性。结果转染NOX2亚基过表达质粒的各组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）。其中，过表达组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与正常H9C2细胞组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）； H9C2转阴性对照质粒组、 RNAi质粒组、益心解毒方中剂量组与过表达组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）； RNAi质粒组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与H9C2转阴性对照质粒组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）；益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与RNAi质粒组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）；益心解毒方中剂量组与益心解毒方高剂量组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）；益心解毒方低剂量组与益心解毒方中剂量组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。转染NOX4亚基过表达质粒的各组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）。其中，过表达组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与正常H9C2细胞组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）； H9C2转阴性对照质粒组、 RNAi质粒组、益心解毒方中剂量组、益心解毒方低剂量组与过表达组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）； RNAi质粒组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与H9C2转阴性对照质粒组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）；益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与RNAi质粒组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；益心解毒方中剂量组与益心解毒方高剂量组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）；益心解毒方低剂量组与益心解毒方中剂量组NADPH氧化酶活性比较，差异有统计学意义（ P＜0.05）。结论 NOX2、 NOX4亚基的过表达可以提高NADPH氧化酶活性，而RNAi表达可以沉默NOX2、 NOX4亚基，从而降低NADPH氧化酶活性，益心解毒方不会直接影响NADPH氧化酶活性。实验研究表明干预和抑制NOX2、 NOX4亚基的NADPH氧化酶活性调控环节，降低心肌活性氧（ ROS）水平，保护心肌细胞，改善心功能，可能是益心解毒方发挥药效的重要机制。
