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核酸血液筛查试剂内标质控效果研究
目的 竞争性内标对核酸检测灵敏度的影响程度及方式,探寻采用适度的内标质控浓度,用于有效控制核酸检测过程.方法 使用竞争性混合内标试剂对不同浓度的HBV、HCV、HIV阳性标本检测,HBV内标浓度<10~3IU/ml,HCV、HIV内标浓度为(200-300)IU/ml.结果 HBV内标浓度<5 IU/ml检出率<95%,浓度>10 IU/ml后检出率≥95%,HCV、HIV内标浓度<100 IU/ml检出率<95%,≥100 IU/ml检出率≥95%.结论 内标(内参照)把质量控制从每批阳性质控提高到每管阳性质控的水平,能有效减少假阴性检测结果,竞争性内标结构和待检物几乎完全相同,更能真实反应情况.
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自动化核酸扩增技术(NAT)在血液筛查中的应用研究
目的 为了提高血液安全性,探讨自动化核酸扩增技术在血站血液筛查中应用的可行性.方法 在酶联免疫试验(ELISA)常规筛查血液的基础上,应用STAR2000加样仪自编程序进行全自动血样汇集(8人份),在KHB-DP1000半自动核酸提取仪上自动化方法提取样本核酸,应用荧光PCR方法在ABI7300上进行扩增和检测分析结果,用临检中心室间质控品和澳大利亚室间质控品进行室间质评,用标准品考评检测限量.结果 应用标准品考评检测限量,本法的95%的检出限量HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA分别为100.9 IU/ml,155.1拷贝/ml和165拷贝/ml,95%可信限范围分别为(60.1、302.2),(98.9,398.6)和(105.2,425.8).通过对16 744个样本共2 093汇集池检测,初始检测HBV DNA阳性池2个,HCV RNA、HIV RNA未检出阳性池,进一步拆分检测,有2份献血者的血液HBV DNA阳性,HBV DNA阳性率为0.012%.结论随着国内相关技术的不断提高和相关制度的不断完善,可以考虑将国产自动化核酸扩增试剂纳入血站血液常规筛查.
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探讨实时荧光PCR法检测乙肝病毒DNA在临床中的应用
目的:探讨实时荧光PCR法检测乙肝病毒DNA在临床中的应用.方法:对168例临床乙肝病毒携带者的血清标本用ELISA法进行定性检测,再用实时荧光PCR定量检测,对两种检测结果进行相关性分析.血清标志物的检测顺序设定为:(1)HBsAg;(2)HbsAb ;(3)HbeAg;(4)HbeAb;(5)HbcAb;(6)PreS1 -Ag.结果:几种乙肝模式中,"大三阳"患者的DNA阳性检出率和拷贝数均比其他模式高,并有显著性差异.PreS1-Ag的阳性率与乙肝DNA的阳性率有很好的一致性,但由于两者检测的成分和表达的意义不完全一致,因此不能等同于或代替HBV-DNA的检测.结论:PCR定量测定HBV-DNA可以真实地反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效的观察.并且实时荧光PCR法检测HBV-DNA具有快速、准确等优点,而且对低复制持续感染乙肝病人也能诊断.
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基于MGB探针法荧光PCR检测手足口病病原的研究
目的 建立一种能同时检测EV71型、CA16型及其它肠道病毒的荧光PCR检测方法,主要用于手足口病病原的快速检测.方法 针对肠道病毒的保守基因设计特异性引物和探针序列,优化荧光RT-PCR反应体系,构建标准的阳性质控模板,建立标准曲线,研究产品的检测限、重复性、特异性;同时对2015年6月份收集的26份阳性样品和10份阴性样品进行检测.结果 试验得到了阳性重组质粒,线性范围在8×102 copics/μl～8×108 copies/μl范围内检测结果良好;优化后肠道病毒EVUN上下游引物和MGB探针浓度分别为0.50,0.50,0.30 μmol/L,RT-PCR反应条件为:42℃30 min,95℃3 min;95℃5 s,60℃35 s,45个循环.检测限达到800 copies/μl,变异系数CV≤5％,重复性好,特异性良好,与其他传染病毒无交叉反应;用该检测方法检测26份临床阳性样本和10份阴性样本,阳性检出率为100％(26/26),阴性检出率为100％(10/10).结论 试验所建立的荧光PCR检测方法,可用于临床对手足口病病原的快速检测.
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双管单色荧光PCR法与基因芯片法检测CYP2C19基因多态性的比较研究
目的 建立快速检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性的实验方法.方法 从样本库中选取100例血液样本.设计针对CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性位点的特异性引物和taqman荧光探针,通过双管单色荧光PCR法检测基因型,与基因芯片法进行比较验证.结果 双管单色荧光PCR法能很好地鉴别CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型,与基因芯片结果一致率为100％.结论 双管单色荧光PCR法能快速有效地进行CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性分型,该方法期待用于临床实验室以指导个体化用药.
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EphA2在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义
目的 探讨EphA2在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义.方法 50例膀胱病理切片标本分为正常对照组、膀胱移行细胞癌Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级4组;25例新鲜组织标本分为正常组织、Ta～T1、T2～T3、T4期4组;并培养具有不同侵袭力的两种膀胱癌细胞株(BIU87和T24).采用免疫组化和荧光实时定量PCR方法检测组织标本和细胞株EphA2在蛋白及mRNA水平的表达.结果 EphA2在膀胱移行细胞癌各组表达与对照组相比均有显著差异.EphA2mRNA在正常组织细胞、T24和BIU87细胞中的相对表达量两两比较均无显著性差异(P>0.05).EphA2mRNA在膀胱组织中除T2～T3期与其他各分期有显著性差异(P<0.05)外,其余各期两两比较均无显著性差异(P>0.05).结论 EphA2的高表达与膀胱移行细胞癌的恶性程度以及患者预后有关,在临床分期中无明显相关性,且EphA2的蛋白表达与基因表达量不成比例.
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积雪草甙对兔耳增生性瘢痕TGF-β1mRNA表达的影响
目的:通过建立兔耳腹侧增生性瘢痕的模型,探讨积雪草甙(Asiaticoside,Ad)~-TGF-β1mRNA表达的影响.方法:新西兰大白兔20只(喂养过程中死亡4只),在兔耳腹侧制备直径为1cm、深达软骨膜的圆形瘢痕93个,随机分为4组:空白对照组、得宝松组、低浓度积雪草甙组(25mg/ml)、高浓度积雪草甙组(50mg/ml),分别于瘢痕制备3天后局部应用相应药物,2周后取材,分别测量瘢痕组织TGF-β1mRNA的表达量.结果:积雪草甙组与空白对照组相比,TGF-β1mRNA表达量明显降低,有明显统计学差异(P<0.01);积雪草甙与阳性对照组相比,二者mRNA表达量无统计学差异(P>0.05);积雪草甙组之间,高浓度组与低浓度组相比有统计学差异(P
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荧光PCR在早期梅毒患者诊断中的应用
目的 探讨荧光PCR在早期梅毒诊断中的应用价值.方法 应用FL-PCR方法检测40例一、二期梅毒患者皮损中梅毒螺旋体DNA,与传统的血清学TRUST和TPPA方法的检测结果进行比较.结果 一期梅毒硬下疳损害中梅毒螺旋体DNA的检出率100.00%,血清TRUST阳性率为59.09%,TPPA阳性率为81.82%;二期梅毒扁平湿疣损害中梅毒螺旋体DNA的检出率100.00%,以斑疹和丘疹表现的二期梅毒疹中梅毒螺旋体DNA的检出率为60.00%,TRUST和TPPA法检测阳性率均为100.00%.结论 荧光PCR法在一期梅毒诊断中有极高特异性和敏感性,可作为一期梅毒早期诊断的依据,二期梅毒诊断血清学方法优于荧光定量PCR法.
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荧光PCR法检测泌尿生殖道沙眼衣原体、解脲支原体感染
目的采用荧光PCR技术检测泌尿生殖道分泌物中沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU),探讨检测CT和UU佳方法.方法应用荧光PCR技术、CT抗原法和UU培养法同时检测75份标本.结果 75份标本中,荧光PCR检测CT阳性率10.6%,与CT抗原法比较符合率98.7%;荧光PCR检测UU阳性率22.7%,与UU培养法比较,符合率100%.结论荧光PCR是检测CT和UU一个较好的方法.
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多重置换扩增(MDA)结合荧光PCR对植入前胚胎进行性别诊断的研究
目的:建立多重置换扩增(MDA)联合荧光PCR对植入前胚胎进行性别诊断的方法,为开展性连锁遗传病的性别筛选提供实验依据.方法:在行IVF-ET助孕的患者中,选取废弃的第3日新鲜或冷冻后的2PN受精胚胎.通过显微操作活检得到单个卵裂球细胞,采用MDA方法对单个/2个卵裂球细胞行全基因组扩增,然后采用荧光PCR方法对AMEL、X22、SRY和XHPRT4个性染色体相关基因或STR位点进行扩增,对其扩增产物行毛细管电泳检测,分析电泳结果确定植入前胚胎的性别.以父母的外周血单个淋巴细胞作为对照进行分析.结果:①采用蛋白酶K法(n=21)和碱法(n=17)对卵裂球细胞进行裂解行MDA,扩增成功率未见统计学差异(85.7％ vs 82.4％,P＞0.05)；单个卵裂球组(n=15)和2个卵裂球组(n=23)MDA扩增成功率亦未见统计学差异(80.0％ vs87.0％,P＞0.05).②利用MDA方法对15个胚胎的单个/2个卵裂球进行扩增,扩增成功率为86.7％(n=13). 13个胚胎中7个为男性,6个为女性,性别检测成功率100％；等位基因脱扣(alleledropout,ADO)发生率为7.7％.结论:PGD中MDA是有效且可靠的全基因组扩增方法,MDA结合荧光PCR可以用于性连锁遗传病的性别筛选、致病基因检测和对胚胎进行HLA分型.
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牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立
[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.
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荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS
根据转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)基因序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针,建立一种应用荧光双链探针的实时PCR定量检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S和NOS基因成分,其余6份样品结果为阴性.结果表明本文建立的荧光PCR方法能有效检测出35S和NOS两种转基因成分,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.
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空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究
空肠弯曲菌是世界卫生组织列为常见食源性传染病菌之一的人兽共患病原菌,传统的分离鉴定方法需要耗费大量工时,并存在敏感性低、难以检出非可培养状态细菌和易出现假阴性结果等问题.本研究首创了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR快速检测方法,无需增菌培养即可直接捕获检样中的弯曲菌,利用实时荧光PCR进行鉴定,可在24h内完成检测,检测低限达到10cfu/mL,提高了非可培养状态空肠弯曲菌的检出率.
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乙型肝炎病毒荧光PCR基因分型方法的建立和应用
[目的]建立一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基因分型(BCD三型)的方法.[方法]大量分析已分型的HBV基因组序列,寻找出HBV各基因型的型特异性碱基的分布规律,设计型特异性的引物和探针,利用已知全序列HBV建立荧光PCR的基因分型方法.并与PCR-RFLP及S基因测序等分型方法作比较.[结果]荧光PCR方法对已知基因组序列的HBV分型结果与基因组分析完全一致,利用大量随机临床标本摸索的佳反应条件为94℃,1 min;94℃,10 s,60℃,30 s,40个循环.与PCR-RFLP相比,分型结果一致性在84.0%;与S基因测序分型相比,一致性为96.2%.[结论]利用荧光PCR能灵敏、快速、准确地进行乙型肝炎病毒基因分型,方便临床应用和流行病学调查.
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以同源异形盒家族HOXC6基因为靶标荧光PCR鉴定地沟油的方法研究
目的：以动物源性的同源异形盒家族 HOXC6基因为靶标建立地沟油鉴定方法。方法：通过基因数据库的筛查、比对及特异性验证，筛选确定以动物源性的同源异形盒家族HOXC6基因为靶标，采用实时荧光PCR方法对正常植物油和地沟油进行鉴定。结果：6个已知来源的地沟油样品全部被鉴定为地沟油，而8个正常食用植物油全部被鉴定为非地沟油。结论：与课题组前期建立的采用针对多个动物物种特异性基因的PCR鉴定方法相比，该研究建立的方法在有效提高检测灵敏度的同时，不但避免了先后扩增多个基因片段的繁琐，同时降低了PCR污染的风险，提高了检测结果的准确性。
