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金铁锁对膝关节骨性关节炎兔关节软骨的保护作用及其机制
目的：观察金铁锁对膝关节骨性关节炎（ OA）兔关节软骨的保护作用，并探讨其作用机制。方法将50只家兔随机分为空白对照组，金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组，各10只。除空白对照组外，其余各组均按照改良Hulth法制备右膝关节OA模型。金铁锁大、中、小剂量组术后分别按体质量称取金铁锁粉末12．80、4．23、2．58 mg／kg，配制药物溶液10 mL灌胃，空白对照组及模型对照组灌服等量生理盐水，1次／d，连用8周。造模第8周处死家兔，取右膝股骨内侧髁组织，采用Mankin评分标准评价关节软骨退变情况，qRT-PCR法检测关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量。结果空白对照组，金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组Mankin评分分别为（0．80±0．20）、（2．60±0．16）、（3．40±0．16）、（5．10±0．38）、（10．40±0．16）分，各组Mankin评分依次升高，组间两两比较均有统计学差异（ P均＜0．01）。模型对照组软骨组织IL-6、TNF-αmRNA相对表达量均高于其余各组，空白对照组均低于其余各组，金铁锁大、中剂量组均低于金铁锁小剂量组（ P均＜0．05）。模型对照组软骨组织IL-1βmRNA相对表达量均高于其余各组，空白对照组、金铁锁大剂量组均低于金铁锁中、小剂量组（ P均＜0．05）。结论金铁锁对膝关节OA兔的软骨具有保护作用，且呈浓度依赖性，机制可能与降低软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达有关。
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金铁锁化学成分和药理活性研究进展
本文对金铁锁的化学成分和药理作用进行综述,为金铁锁的进一步开发和合理应用提供理论依据.
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影响金铁锁毛状根生长及皂苷积累的因素
目的 优化金铁锁毛状根液体培养基、碳源、激素和培养条件,促进毛状根生长及皂苷的积累.方法 将毛状根置于添加了碳源和植物生长调节剂的液体培养基中培养,观察其形态、色泽变化,测定其生物量和皂苷含量.结果 金铁锁毛状根在含有30g·L-1蔗糖的1/2MS中生长快；6- BA、2,4 -D均能促进皂苷的合成,但对毛状根的生长有抑制作用；添加少量的NAA、IAA、IBA都能促进毛状根的生长和皂苷产量的提高,当分别添加0.5 mg·L-1NAA、IAA、IBA时,皂苷产量较对照品提高53.42％,25.55％,79.60％.结论 通过液体培养基、碳源、激素等因素的改变,可以提高金铁锁毛状根的生长速度和皂苷的含量.
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不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响
目的 研究不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累规律的影响.方法 改变培养基中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度,比色法测定愈伤组织中皂苷的含量.结果 金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累的适培养基成分为蔗糖40 g·L-1,KNO3∶NH4NO3为(1.9:1.65)g·L-1,1 mmol·L-1KH2PO4,4.5 mmol·L-1CaCl2.结论 蔗糖作为碳源有利于金铁锁愈伤组织生物量的积累和金铁锁皂苷的生物合成.混合氮源有利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量的积累.
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苗药金铁锁药材和植物细胞培养产生的总皂苷含量比较
目的 比较金铁锁药材和植物细胞培养产生的植物愈伤组织、毛状根中总皂苷含量.方法 采用紫外可见分光光度法,以齐墩果酸为对照品,在波长535 nm处测定样品中的总皂苷含量.结果 齐墩果酸在0.008 112～0.048 672 mg/ml范围内呈现良好的线形关系,该法平均加样回收率为100.77%,RSD=2.44%(n= 9).测得金铁锁药材,金铁锁植物愈伤组织1,金铁锁植物愈伤组织2和金铁锁毛状根中总皂苷的含量分别为0.217%,0.388%,0.221%和0.857%.结论 金铁锁悬浮培养毛状根中总皂苷含量较高,应用价值较大.
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金铁锁化学成分、药理作用及次生代谢研究进展
金铁锁为苗族常用药,有抗类风湿性关节炎作用.随着野生资源的不断缩减,加快其次生代谢研究显得尤为重要.该文综述了金铁锁的化学成分、抗类风湿性关节炎药理作用,介绍了其毛状根培养及三萜合成中重要酶的研究状况,希望能为金铁锁次生代谢工程的研究提供参考.
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金铁锁糖基转移酶UGT71G1的克隆与生物信息学分析
目的 克隆金铁锁糖基转移酶全长基因,并进行生物信息学分析.方法 根据转录组数据,反转录获得全长cDNA,通过生物信息学软件对该基因蛋白特性及系统发育树进行分析.结果 克隆得到cDNA全长序列,命名为UGT71 G1,该cDNA全序列长1402 bp,包含一条1107 bp完整开放阅读框,编码368个氨基酸,预测相对分子质量为41.05KD,等电点6.03在155位到336位置处存在高度保守UDPGT结构功能域,经多重序列比对与同科植物香石竹具有很高的同源性.结论 成功克隆、分析了金铁锁UGT71 G1基因,为金铁锁有效成分合成关键酶基因及调控机制研究提供基础.
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金铁锁FPS基因的克隆及表达分析
目的 从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶法尼基焦磷酸合酶基因FPS,进行序列特征分析和不同组织中的表达情况.方法 根据已获得的金铁锁转录组数据,设计FPS基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得金铁锁FPS基因的全长cDNA序列,并进行TA克隆、序列分析及原核表达;并设计Real-time PCR扩增引物,测定FPS在不同组织中的表达量.结果 FPS cDNA全长1135bp,开放阅读框1029bp,编码342个氨基酸;构建了pEASY-E1-FPS重组质粒,获得稳定的原核表达体系.Real-time PCR结果表示FPS基因在根中的表达量高于叶和茎.结论 成功克隆了金铁锁FPS基因,构建了稳定的pEASY-E1-FPS原核表达体系,FPS基因的表达分析表明,FPS在金铁锁不同组织均有表达,根中表达量高.为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础.
关键词： 金铁锁 法尼基焦磷酸合酶(FPS) 基因克隆 表达分析 -
金铁锁全长cDNA文库的SMARTer技术构建
目的 构建金铁锁全长cDNA文库,为进一步开展金铁锁次生代谢合成途径相关基因的研究奠定基础.方法 利用Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen)试剂盒提取金铁锁根部总RNA,通过SMARTer(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术构建全长cDNA文库,测定分析文库重组率及插入片段大小,对文库进行随机测序并通过Blastx分析后在Genbank中进行同源性检索和功能分析.结果 使用SMARTer技术构建的金铁锁cDNA文库的质量较高,在随机挑选的单菌落克隆中都有插入片段,重组率为100％;在15个单克隆中,扩增片段长度在750bp以上的有14个,占93.3％.结论 利用SMARTer技术成功构建了金铁锁根部的全长cDNA文库,该文库可用于金铁锁今后功能基因组鉴定、新基因筛选及次生代谢产物生物合成的表达调控研究.
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西南民族药金铁锁的研究现状及展望
对西南特有植物金铁锁的生药学、化学成分、药理学和临床研究以及通过人工栽培、组织培养和遗传学等研究取得的生物保护和资源利用方面的进展进行了综述,分析了目前研究存在的不足和面临的问题,提出了有待继续深入和加强研究的方向及建议.
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金铁锁提取工艺的研究
目的:优选金铁锁的提取工艺.方法:采用正交试验法,以金铁锁提取物提取率为主要考察指标,结合生产成本,对影响金铁锁提取工艺的因素进行了研究.结果:试验设计三因素中提取方式有显著影响.结论:金铁锁的佳提取工艺为:金铁锁根粉用80%乙醇浸渍3次,48 h/次,过滤,滤液减压浓缩成浸膏,加水溶解,水溶液经DM-101型大孔吸附树脂柱层析,分别用10%、20%及80%的乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压浓缩经喷雾干燥得金铁锁提取物.
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金铁锁不同居群rDNA ITS序列分析
目的:分析金铁锁不同居群的核糖体ITS碱基序列,为鉴别不同产地金铁锁提供分子依据.方法:使用1对引物18P1和26P2进行ITS基因的PCR扩增并测序.结果:12个居群金铁锁的ITS1片段长度为225~229 bp,ITS2片段长度为166~170 bp,5.8S片段长度为261~264 bp.云南昆明、丽江、个旧、鹤庆和四川盐源5个居群的ITS序列碱基完全一致,云南宣威、会泽、中甸、保山、四川木里、西藏林芝等7个居群的ITS序列则有不同的变化,碱基变异数目(包括5.8 S编码区)为1~4个.结论:经过比较分析,rDNA ITS区碱基序列在分布于云南中部、四川西南端等居群与云南西部、西北端、西藏东南部、四川西南部居群具有各自相应的指纹特征,可以作为相应居群的鉴别依据.
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金铁锁不同居群培养物生长量比较
多从金铁锁Psammosilence tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu 8个不同居群的组培物生长量比较,初步筛选出云南丽江云杉坪和昆明小墨雨两居群比其他居群有优势,可考虑作为优良种源.
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金铁锁居群繁殖生物学初步研究
云南省昆明市小墨雨调查样地的金铁锁,主要生长于以石灰岩为母岩的酸性红壤土,居群呈成群型分布.在自然条件下只以种子行有性繁殖;种子成熟散布后,随即发芽形成幼苗;幼苗可成功越冬者,经2～3年达到性成熟;每株有花序1～5条,为二或三歧聚伞花序,每花序平均有花20.64朵,仅顶花能形成果实.
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金铁锁种子萌发试验
目的:了解金铁锁种子萌发特性.方法:将新采的金铁锁种子,当天用培养皿和花盆播种.结果:培养皿开始发芽时间为播后的第7天,发芽高峰为播后的第17天,发芽结束时间为播后的第22天,发芽率46.7%,盆播开始出苗时间为播后的第15天,出苗高峰为播后的第21天,出苗结束时间为播后的第45天,出苗率为58.1%.结论:金铁锁种子在人工环境下容易萌发,无休眠现象,但出苗时间持续较长.
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金铁锁毛状根诱导的初步研究
目的:建立金铁锁毛状根诱导体系.方法:用发根农杆菌A4和C58CI菌株分别诱导金铁锁外植体获得毛状根,并对毛状根诱导过程中的多个因素进行优化.结果:金铁锁毛状根诱导的佳条件为选择幼嫩茎段和幼嫩叶片作为外植体,在培养基1/2MS+ AS 100 μmoL/L上预培养2d,用OD600=0.6的农杆菌浓度侵染15 min,在培养基1/2MS+ AS 100μmoL/L上共培养3d,转接至抑菌培养基1/2MS+ Cef 300 mg/L进行毛状根的诱导.结论:已建立起金铁锁毛状根诱导体系,为后续金铁锁有效成分的提高及金铁锁基因工程的研究积累材料.
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濒危药用植物金铁锁的传粉生物学研究
目的:揭示金铁锁开花规律与传粉特征,确定其繁育系统类型,为金铁锁引种繁育和濒危原因探寻提供基础依据.方法:开花动态的观察、杂交指数估算法、繁育系统检测法、种子萌发率和访花昆虫及其访花行为的观察.结果:杂交指数检测与繁育系统检测结果一致,金铁锁的繁育系统为同株自花传粉、同株异花传粉、异株异花传粉.金铁锁的花在结构上具有与异花授粉相适应的结构和机制,也有虫媒花的特征.金铁锁的盛花期在雨季,其访花昆虫在雨季少见或不传粉,从而直接影响了结实率.结论:金铁锁为混合交配繁育系统,为虫媒异交植物,同时可以自花授粉,其繁殖方式为近交繁殖.
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金铁锁β-actin基因克隆及其作为内参基因的研究
目的:建立金铁锁β-actin基因实时荧光定量PCR方法,为金铁锁实时荧光定量PCR的检测提供了内参基因.方法:根据GenBank上β-actin基因保守区域设计特异性引物,利用PCR扩增的方法扩增β-actin目的片段.并以β-actin作为内参基因,利用荧光定量PCR技术对糖基转移酶基因(UGT)在金铁锁根、茎、叶组织中的表达情况进行分析.结果:扩增到金铁锁的β-actin基因序列,长度为153 bp,与王不留行、鹅肠菜、马齿苋的β-actin有较高的同源性.而糖基转移酶基因在以β-actin作为内参基因时能够在金铁锁的不同组织稳定表达.结论:金铁锁β-actin基因是一个可靠的内参基因,适合在金铁锁三萜皂苷生物合成相关功能基因的表达研究中作为内参基因.
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金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达
目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析.方法:在转录组数据分析的基础上,利用RT-PCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长cDNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量.结果:得到2条SE cDNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了pEASY-E1-SE-1及pEASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致.Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶.结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础.
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金铁锁多倍体诱导的初步研究
目的:采用多倍体育种技术对金铁锁进行多倍体诱导试验,以期获得金铁锁多倍体植株.方法:在组织培养条件下,利用秋水仙素作为诱导剂,对二倍体组培苗进行诱导,比较不同预培养时间和不同处理浓度、不同处理时间下秋水仙素对金铁锁进行染色体加倍的诱导效果.结果:金铁锬茎段在分化培养基上预培养3d后,再在附加有40 mg/L秋水仙素的分化培养基中处理2d的诱导效果佳,其变异率达到19.05％.金铁锁多倍性植株“同质化”处理的佳次数为5次.对获得的经形态观察初筛的变异植株根尖进行染色体计数后发现,变异植株根尖细胞染色体为2n=4X=56,为四倍体.未加倍的植株染色体为2n=2X=28,为二倍体.观察中也发现有少数变异植株根尖同时存在有28和56条染色体的细胞,为嵌合体.结论:利用组织培养结合秋水仙素的方法,在短期内可获得较多纯合的金铁锁多倍体植株.
