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阳春砂和在烟草中单独及共同过量表达调控萜类化合物的生物合成
目的：HMGR 和DXR 分别是萜类生物合成途径---MVA和MEP途径的关键酶，本研究探讨阳春砂A vHMGR 和A vDXR 在转基因烟草中的过量表达对不同萜类化合物生物合成的影响。方法：采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术分析A vHMGR 和 A vDXR 的表达水平，应用专一底物法测定 HMGR 和DXR 的酶活性，利用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测不同萜类化合物的变化。结果：A vHMGR 或A vDXR 单独过量表达抑制了HMGR 和DXR 的活性，提高了五针松烯、新植二烯、薄荷烯和甾醇的含量；而A vHMGR 和A vDXR 共同过量表达对不同植株中酶活性的影响有差异，提高了甾醇和植醇的含量，但抑制了新植二烯的积累。结论：A vHMGR 和A vDXR 单独或共同过量表达对烟草中不同萜类化合物的合成调控存在差异，同时也证明了MVA和MEP途径并不完全独立，而是有着相互交流，本研究为利用阳春砂A vHMGR 和A vDXR 进行萜类化合物的代谢调控提供了依据。
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药用植物萜类生物合成HMGR基因研究进展
药用植物中萜类次生代谢产物种类丰富,数量巨大,其现代药理活性相当突出.3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-metllylglutaryl coenzyme Areductase,HMGR)作为萜类成分甲羟戊酸(MVA)合成途径上第一个重要限速酶,对药用植物萜类活性成分生物合成过程起着至关重要的作用.文章系统综述了HMGR的生物学意义、催化机制,HMGR克隆情况、基因结构、以及在重要药用植物丹参、甘草、红豆杉等中的研究进展.
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甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs检测体系的建立
目的:建立可用于甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs测定的稳定可靠的检测体系.方法:利用Real timePCR方法对甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs进行测定.结果:在HMGR,SQS1,β-AS合酶基因以及内标基因lectin的定量检测实验中,其定量反应的Ct值分别在25.82～25.88,29.01 ～29.08,15.52 ～15.56,19.06～ 19.08变化,SD分别是0.033,0.032,0.024,0.011,其CV分别是0.12％,0.22％,0.16％,0.06％.结论:所建立的Real time PCR体系重复性好,检测系统工作稳定可靠,可用于甘草HMGR,SQS1,β-AS基因的CNVs筛选.
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乌拉尔甘草HMGR基因cDNA的克隆与序列分析
目的:对乌拉尔甘草3.羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR)的cDNA克隆并进行序列分析.方法:根据NCBI数据库中的豆科其他物种HMGR的cDNA保守区设计引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从甘草根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开发阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Clustal x比对已有HMGR的氨基酸序列,并构建进化树.结果:得到1个全长为1 842 bp的HMGR的cDNA序列,含有1 722 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码573个氨基酸,具有HMGR家族的特异序列,推测的氨基酸序列与豌豆、蒺藜苜蓿的氨基酸序列一致性分别为84%,76%.结论:对甘草HMGR基因的cDNA进行了克隆,为进一步研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A在甘草酸生物合成途径中的作用提供了理论依据.
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甘草HMGR基因cDNA的克隆及功能鉴定
甘草为常用中药材,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用.甘草酸是甘草中的主要活性成分,其生物合成途径受到许多酶的调控,其中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutary CoA,HMG-CoA)生成甲羟戊酸(MVA),是该途径中的第一个限速酶.本文克隆了甘草HMGR基因cDNA序列,对其进行序列分析,并与其他物种进行序列比对.构建了原核表达载体,诱导其外源表达及酶促反应,并利用TLC及GC-MS对产物进行检测.结果表明本文克隆得到的HMGR序列能很好的完成特定的酶促反应任务.由于HMGR基因在甘草酸生物合成途径中的重要作用,因此本实验的研究结果对于在分子水平上揭示高品质甘草的形成机制具有一定的意义.
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基于HMGR、SQS1、β-AS基因CNVs的甘草道地性机制研究
本文利用real-time PCR方法对不同产地甘草的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)、鲨稀合成酶1(squalene synthetase 1,SQS1)、β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因的拷贝数进行了研究,发现不同产地的HMGR基因存在1～3个拷贝数变异,SQS1基因存在1～2个拷贝数变异,未发现β-AS基因拷贝数变异.甘草HMGR、SQS1、β-AS基因拷贝数存在5种自然组合类型:A型(2+1+1)、B型(1+1+1)、C型(3+2+1)、D型(2+2+1)和E型(3+1+1),其中内蒙古杭锦旗甘草存在A、B两种类型,A与B的比例为1∶1.3；内蒙古赤峰甘草也存在A、B两种类型,但A与B比例为3∶1；宁夏盐池甘草存在A、B、C、D4种类型,A/B/C/D比例为1∶5.1∶1∶2,A/B比例为1∶5.1；甘肃民勤甘草存在A、B、E3种类型,A/B/E比例为4.1∶2.1∶1,A/B比例为2∶1.本研究证明中药功能基因基因组拷贝数变异(copy number variations,CNVs)与产地具有相关性,可能是道地药材形成的机制之一.
