溪黄草DNA条形码鉴定研究

目的：研究DNA条形码技术在溪黄草药材品种鉴定中的适用性。方法：选取rbcL、psbA-trnH、matK和ITS2等4个条形码标记，对41份溪黄草药材样品（含溪黄草Rabdosiaserra、线纹香茶菜R. lo-phanthoides和纤花香茶菜R. lophanthoidesvar. graciliflora）进行DNA提取、PCR扩增及双向测序，对测序结果进行质量检查、人工校对和序列拼接获取标准碱基序列信息，通过比较序列获得成功率以及物种鉴定力（TaxonGap法），筛选适合溪黄草基原鉴定的DNA条形码序列。结果：条形码序列获得成功率依次为rbcL（100%）、psbA-trnH（90.2%）、ITS2（87.8%）和matK（70.7%）；物种鉴定力方面，rbcL、psbA-trnH和ITS2等3条序列均可有效鉴定不同物种，但不适于分辨种下单位。结论：综合考察序列易得性和物种鉴定力，rbcL可作为溪黄草品种鉴定的首选条形码。

茜草“隐性品种”的鉴定及其质量的影响研究

目的:采用DNA条形码技术,研究茜草药材的“隐性品种”及质量.方法:提取23份茜草饮片的DNA,对ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK序列扩增和测序,比较扩增测序效率,DnaSP分析变异位点和单倍型,MEGA构建系统发育树,发现茜草药材的“隐性品种”,分析“隐性品种”对茜草质量的影响.结果:ITS和ITS2序列由于多拷贝和真菌污染现象,psbA-trnH序列由于高poly结构,扩增和测序成功率均较低.rbcL序列的扩增和测序效率较高,截去引物区,所得序列长度为553bp,共3个变异位点.聚类分析将所有样品分为两个分支,第一分支占73.9％,与正品茜草聚为一支;第二分支形成独立的分支,没有和正品茜草聚为一支,由于这两个分支的茜草药材性状没有明显区别,将未和正品茜草聚成一个分支的样品称为“隐性品种”;第一分支的大叶茜草素和羟基茜草素含量明显高于第二分支.结论:DNA条形码可以用于中药“隐性品种”的发现,隐性品种影响药材质量,应加强对中药“隐性品种”的研究.

栀子叶绿体DNA条形码的研究

目的：评价3个叶绿体DNA(cpDNA)条形码候选序列对茜草科植物栀子属的鉴别能力,探索栀子属植物鉴定的新方法。方法使用matK、rbcL和psbA候选序列的通用引物对栀子属植物cpDNA进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增成功率、长度、种内和种间变异、barcoding gap,并采用BLAST和DNA MAN进行分析评价。结果 matK、rbcL、psbA序列对栀子属3个物种、5个样本的扩增成功率均为100%,其中通用引物matK扩增的序列种内种间变异差异、barcoding gap较psbA、rbcL序列具有更明显的优势,其鉴定成功率相对较高。结论 matK是适合栀子属植物鉴别的较好cpDNA条形码。

ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物

目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力.方法:选择psbA-trnH,rbcL,marK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcoding gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力.结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6％,83.6％,96.4％,98.2％,其鉴定成功率除rbcL为77.8％,75.9％外都为100％,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势.ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5％,87.6％.结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合.

罂粟属植物核心DNA条形码的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术.为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列.应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析.分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开.综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码.

基于DNA条形码分析的霍山石斛及其常见混伪品的初步研究

该研究选择叶绿体基因rbcL,matK及核基因组ITS2序列初步探讨石斛属植物的系统发育关系,筛选可用于石斛属药用植物鉴定的DNA条形码通用序列,分析应用DNA条形码对霍山石斛及伪品进行品种鉴定的可能性.使用ITS2,rbcL,matK序列的通用引物对石斛属植物进行扩增测序,通过比较各序列的扩增和测序成功率,种内和种间的变异等指标,运用Bi-oEdit,MEGA 5.0等软件分析序列,构建NJ分子系统树,进而评价不同序列的鉴定能力.结果表明ITS2序列不仅在石斛属种内变异和种间变异大,而且有明显的条形码间隙,种内变异和种间变异重合较少,ITS2序列不同石斛种形成单系分支的百分比也高,能较好地区分不同种类的石斛.rbcL和matK序列扩增成功率低、NJ系统树可靠性不高,rbcL和matK序列构建的系统树中形成单系的物种支持百分比例均较低.因此ITS2序列可以作为DNA条形码用来鉴别霍山石斛和铜皮石斛、铁皮石斛.

ObjectivePoisonous plants are a deadly threat to public health in China. The traditional clinical diagnosis of the toxic plants isinefficient, fallible, and dependent upon experts. In this study, we tested the performance of DNA barcodes for identification of the most threatening poisonous plants in China. MethodsSeventy-four accessions of 27 toxic plant species in 22 genera and 17 families were sampled andthree DNA barcodes (matK,rbcL, and ITS) were amplified, sequenced and tested.Three methods, Blast,pairwise global alignment (PWG)distance, and Tree-Building were tested for discrimination power. ResultsThe primer universality of all the three markers was high. Except in the case of ITS for Hemerocallisminor, the three barcodes were successfully generated from all the selected species. Among the three methodsapplied, Blast showed the lowest discrimination rate,whereasPWGDistance and Tree-Building methods were equally effective. The ITS barcode showed highest discrimination rates using the PWG Distance and Tree-Building methods. When the barcodes were combined, discrimination rates were increased for the Blast method. ConclusionDNA barcoding technique provides us a fast tool for clinical identification of poisonous plants in China.We suggestmatK,rbcL, ITS used in combination as DNA barcodes for authentication of poisonous plants.

连翘败毒丸中原料药材的分子鉴别

为研究分子标记技术在成药鉴定方面的应用,本文选用连翘败毒丸为研究对象,采用改良CTAB法提取其总DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对psbA-trnH和rbcL两个叶绿体序列进行梯度扩增,将扩增产物与口pEASyTM-T5 vector连接后,转化到大肠杆菌Transl-T1感受态细胞中,挑取单克隆,并选择阳性克隆进行测序.所得序列校正、比对后,进行BlastN比对分析,同时采用MEGA 4.0软件构建系统聚类树.结果表明,通过psbA-trnH序列分析可以鉴定出9种原料药材,rbcL序列分析可以鉴定出6种原料药材.本研究结果说明采用分子标记技术鉴定中成药原料具有一定的可行性.

茜草及其混伪品DNA条形码鉴定

目的 正确鉴别中药材茜草及其混伪品.方法 本实验对茜草及其混伪品共13个物种的psbA-trnH、matK和rbcL共317条序列进行分析,建立DNA条形码鉴定体系.采用MEGA5.1进行种内种间变异及K2P(Kimura-2-Parameter)遗传距离分析,并构建NJ系统聚类树,评价psbA-trnH、matK和rbcL序列及其组合对茜草与混伪品的鉴定能力.结果 76份基原植物样品的DNA均能成功提取,psbA-trnH、matK和rbcL序列扩增成功率分别为100％、96％和99％.psbA-trnH、matK和rbcL单个序列及其两两组合,能将茜草与不同属的混伪品成功区分,但对同属其他物种鉴定效果不理想.psbA-trnH+ matK+ rbcL组合序列鉴定效果好,种内K2P遗传距离为0～0.001 4,种间K2P遗传距离0.000 7～0.630 3;NJ树显示茜草能与其混伪品茜草属其他8个物种以及紫金牛、丹参、川赤芍、蓬子菜明显区分.市场购买的30份未鉴定的茜草药材中,22份样品能成功扩增3个基因片段,采用NJ树分析,其中11份样品与茜草聚为一支,剩余样品聚为单独3支,为茜草属其他物种.结论 psbA-trnH+matK+ rbcL组合序列能作为DNA条形码对茜草及其混伪品进行鉴定.

基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定

目的 筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列.方法 采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter (K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树.结果 共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100％.比对后序列长度为255～723 bp,GC量范围为30.6％～68.2％.psbA-trnH基因序列的大种内遗传距离均小于小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap.基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定.结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列.

牛奶菜属植物及其近缘植物的ITS2、rbcL序列分析

目的 分析ITS2、rbcL序列在牛奶菜属植物及其近缘植物间的鉴别能力,并对牛奶菜属植物及其近缘植物的系统进化进行初步分析.方法 采用直接测序法测定所分析样品的ITS2、rbcL序列,获得的序列采用软件CodonCode Aligner人工校正,Contig软件拼接,用MEGA 4.0软件分析比对并进行遗传距离等分析,用NJ法对比对的序列构建系统分支树.结果 ITS2、rbcL序列对牛奶菜属植物及其他所分析样品有较好的鉴别能力,且鉴别能力ITS2优于rbcL;南山藤属、匙羹藤属植物与牛奶菜属植物间的亲缘关系非常相近.结论 条形码ITS2、rbcL序列能很好地区分牛奶菜属植物,且鉴别能力ITS2优于rbcL;建议将南山藤属、匙羹藤属等小属植物归入牛奶菜属内.

娑罗子基原物种的DNA条形码鉴定研究

目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列.方法 考察了七叶树属10个物种42份样品的核ITS、ITS2与叶绿体sbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率,对初筛后的序列进行barcodinggap检验及NJ树聚类分析.结果 psbA-trnH序列的PCR扩增和测序效率均为100％,种间小变异大于其种内大变异,且鉴定效率为候选序列中高,barcoding gap检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小,且NJ树聚类分析结果也表明sbA-trnH序列能够提供充分的辨析效果.结论 psbA-trnH序列能准确鉴定七叶树属药用植物,可作为七叶树属药用植物条形码序列.

浙南忍冬属药材rbcL基因序列分析

目的:分析浙南忍冬属药用植物叶绿体rbcL基因序列,探讨其差异.方法:Primer Premier 5.0设计引物,用于rbcL基因PCR扩增,ClustalX1.83进行序列全比对.MEGA 4.0分析转换值、颠换值等；以七子花Heptacodium miconioides为外类群,邻接法(Neighbor-Joining,NJ)和大简约法(Maximun Parsimony,MP)进行聚类分析(models:p-distance)；自展法(Bootstrap)检验各分支可信度.结果:5种忍冬属药材rbcL基因片段长度在1 143～1 167 bp之间,手工校正后长度为1 137 bp,保守位点1 126个,变异位点11个,简约信息位点6个,碱基转换和颠换分别为3和2,比值为1.6;MP和NJ两种方法所得结果几乎一致,均将5种忍冬属药材分为两大支,黄褐毛忍冬与忍冬为第一大支,红腺忍冬、华南忍冬和灰毡毛忍冬为第二大支.结论:rbcL基因能够从分子水平揭示5种忍冬属药材的差异,为忍冬属药材鉴定以及系统发育提供重要参考依据.

落葵薯DNA条形码筛选及其近缘植物的分子鉴定

目的:利用DNA条形码鉴定落葵薯及其近缘植物.方法:对来自不同产地的28份落葵薯及其近缘植物的核基因ITS序列和ITS2序列、叶绿体基因matK序列、psb A-trnH序列和rbcL序列进行PCR扩增并测序,比较不同序列的PCR成功率及测序成功率,对各序列进行种内和种间变异分析,Barcoding gap检验,以及构建NJ树聚类分析,评估不同序列对落葵薯及其近缘植物的鉴别能力.结果:经PCR扩增、测序后发现落葵psb A-trnH序列出现碱基缺失事件,其他序列均扩增、测序成功;matK序列和rbcL序列的测序成功率均为100％,ITS序列和ITS2序列的测序成功率分别为78.75％和64.28％;4条序列中,ITS序列和matK序列的种内和种间距离分别在barcodinggap检验中明显分离;从NJ树来看,ITS序列、matK序列均可区分落葵薯及其近缘植物.结论:建议采用ITS序列及matK序列作为落葵薯及其近缘植物鉴定的DNA条形码.