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益气通络解毒方和吉非替尼含药血清对H1975细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨不同剂量益气通络解毒方联合吉非替尼(gefitinib)含药血清对人非小细胞肺癌H1975细胞株的增殖抑制和凋亡作用.方法:应用中药血清药理学方法制备益气通络解毒方低、中、高剂量(15.75,31.5,63 g·kg-1)及益气通络解毒方低、中、高剂量(15.75,31.5,63 g·kg-1)联合吉gefitinib(22.5 mg·kg-1);gefitinib(22.5 mg·kg-1),0.9％氯化钠溶液(NS)含药血清;H1975细胞6×104/mL单细胞悬液每孔100 μL接种于96孔板;H1975细胞1×105/mL单细胞悬液每孔2 mL分别接种于6孔板及6孔板内盖玻片上,缨胞贴壁后加入含有10％上述含药血清的RMP1-1640培养液分别干预24,48,72 h,CCK-8法检测各组含药血清作用不同时间后对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测各组含药血清作用不同时间后对细胞凋亡的影响;免疫组化法检测不同时间凋亡细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达.结果:除NS组外,各组含药血清对H1975细胞均有抑制增殖作用,益气通络解毒方高剂量含药血清作用72 h抑制率为23.81％,益气通络解毒方高剂量联合gefitinib含药血清抑制率高为42.86％;与NS对照组比较,各组含药血清对H1975细胞均有诱导其凋亡作用,益气通络解毒方高剂量及其联合gefitinib含药血清作用72 h,H1975细胞凋亡率分别为10.29％,25.77％;凋亡蛋白Caspase-3表达与药物剂量、作用时间呈正相关,益气通络解毒方高剂量联合gefitinib含药血清的作用强.结论:益气通络解毒方联合gefitinib可有效的抑制肺腺癌H1975细胞增殖并诱导其凋亡,增加Caspase-3蛋白表达可能是其促进H1975细胞凋亡的机制之一.
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西妥昔单抗与盐酸埃克替尼联用可以克服表皮生长因子受体T790M突变非小细胞肺癌的继发耐药
目的 研究西妥昔单抗与盐酸埃克替尼联合应用克服表皮生长因子受体(EGFR)T790M突变非小细胞肺癌(NSCLC)继发性耐药的机制,为临床合理应用提供依据.方法 以不同浓度的西妥昔单抗和盐酸埃克替尼单药或联合用药处理EGFRT790M突变的NSCLC细胞系H1975,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡.将H1975细胞接种于裸鼠,建立裸鼠移植瘤模型,以西妥昔单抗和盐酸埃克替尼单药或联合用药治疗裸鼠移植瘤,观察移植瘤的生长和组织形态的变化.采用免疫组化染色检测各组裸鼠移植瘤组织中小鼠抗人增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67蛋白的表达,采用Western blot法检测裸鼠移植瘤组织中EGFR信号通路相关蛋白的表达.结果 体外实验结果显示,随着西妥昔单抗和盐酸埃克替尼浓度的增加,H1975细胞的增殖能力逐渐减弱,且联合用药组显示出比相同浓度的单药组更强的增殖抑制性.0.5 μmol/L盐酸埃克替尼+1μg/ml西妥昔单抗处理组和5 μmol/L盐酸埃克替尼+10 μg/ml西妥昔单抗处理组H1975细胞的凋亡率分别为(22.03 ±2.41)％和(42.75 ±2.49)％,均明显高于相同浓度的单药组(P＜0.05).裸鼠体内实验的结果显示,空白对照组和盐酸埃克替尼组裸鼠移植瘤的体积均随时间的延长逐渐增大,至28 d时,移植瘤体积分别为(614.5±10.8)mm3和(611.2 ±8.7)mm3;而西妥昔单抗组和联合用药组移植瘤的体积随时间的延长逐渐缩小,至28 d时,移植瘤体积分别为(30.8±2.0)mm3和0.联合用药组移植瘤组织中Ki-67和PCNA蛋白的表达下降,EGFR信号通路相关蛋白STAT3、AKT和MAPK的磷酸化水平下调.结论 西妥昔单抗和盐酸埃克替尼联合应用可以抑制EGFRT790M突变NSCLC细胞系H1975的增殖,促进凋亡;西妥昔单抗和盐酸埃克替尼联合应用可通过下调PCNA和Ki-67蛋白的表达以及EGFR信号相关蛋白的磷酸化,抑制裸鼠移植瘤的生长.
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瑞香狼毒提取液逆转EGFR-TKI耐药肺腺癌H1975细胞的作用及其机制
目的:探讨瑞香狼毒(stellera chamaejasme L,SCL)乙醇提取液逆转表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)耐药肺腺癌H1975细胞的作用及其机制.方法:用MTT法检测SCL、吉非替尼(gefitinib)及两药联用对H1975细胞的抑制率,细胞划痕实验检测药物对H1975细胞迁移的影响,流式细胞术测定药物对细胞凋亡的影响,Western blotting检测不同药物处理后各组肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及细胞通路关键分子p-EGFR的表达.观察SCL联用gefitinib后裸鼠移植瘤的体积和总生存期(OS),ELISA检测荷瘤裸鼠血清中Bcl-2、p-EGFR含量.结果:SCL对H1975细胞IC50为(21.35±2.11)mg/ml,gefitinib的IC50为(11.21±1.68) μmol/L.SCL联用gefitinib后H1975细胞抑制率明显高于gefitinib(1 μmol/L)和SCL(5 mg/ml)两组单独应用[(49.78±7.09)％ vs (8.45±2.57％)、(12.88±3.64)％,均P＜0.01],两药联用H1975细胞迁移指数明显低于gefitinib和SCL两组单独应用[(22.4±6.5)％ vs (70.3±4.9)％、(67.1±10.5),均P＜0.01],流式细胞仪检测显示两药联用细胞凋亡率明显高于两者单用[(51.68±6.56)％ vs(9.88±2.71)％、(9.48±2.45)％,均P＜0.01],Western blotting检测H1975细胞凋亡相关蛋白发现,联用组可明显降低Bcl-2和p-EGFR的表达(P＜0.01).抑制移植瘤实验显示,联用药组荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,OS明显延长(P＜0.01).结论:SCL可逆转肺腺癌H1975细胞对EGFR-TKI的耐药,其机制可能与降低EGFR的磷酸化、下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关,从而为EGFR-TKI耐药肺腺癌治疗提供了新思路.
关键词： 瑞香狼毒 吉非替尼 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 H1975细胞 肺腺癌 -
新型CRM1抑制剂S109通过阻断核输出抑制非小细胞肺癌细胞增殖
目的:研究新型染色体区域稳定蛋白1(chromosome region maintenance 1,CRM1)抑制剂S109对非小细胞肺癌细胞增殖的影响及其机制.方法:S109作用于非小细胞肺癌细胞株H1975和H1650,以CCK-8法检测其对细胞生长的影响,以EdU法检测细胞中对细胞增殖的影响,以集落形成实验检测对细胞克隆形成能力的影响,以流式细胞术检测其对细胞周期的影响,以免疫荧光法检测对核输出标志蛋白RanBP1细胞内定位的影响,以Western blotting检测对细胞中CRM1和Cyclin D1蛋白表达的影响.结果:S109(0.04、0.2、1、5、25和50 μmol/L)可以剂量依赖方式显著抑制非小细胞肺癌H1975和H1650细胞生长(IC50值分别为1.4和1.2 μmol/L);2和4μmol/L的S109均可以显著抑制非小细胞肺癌增殖[(51.3±2.8)％、(23.2±2.1)％ vs(100±1.2)％,P＜0.01]和克隆形成[(43.6±3.2)％、(26.8±2.8)％ vs(100±1.4)％,P＜0.01],并使细胞阻滞在G1期(G1期细胞数量由50.5％增加至74.9％).S109可以特异性抑制核质转运标志蛋白RanBP1的核输出,并诱导CRM1蛋白降解.结论:S109通过特异性抑制CRM1功能阻断核输出,从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖并阻滞细胞周期.
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新型表皮生长因子受体抑制剂抗T790M型非小细胞肺癌作用
目的 观察7个FCN系列表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂对H1975细胞体内外抗肿瘤作用.方法 采用非小细胞肺癌(NSCLC) H1975细胞(T790M突变)和人表皮鳞癌A431细胞(WT-EGFR)体外增殖抑制试验对7个FCN系列化合物进行筛选,得到抗肿瘤活性强且选择性更好的化合物.通过细胞划痕实验、流式细胞术分别测定化合物对细胞迁移能力、细胞周期和凋亡的影响,通过H1975细胞裸鼠移植瘤实验明确化合物在体内对肿瘤生长的影响.结果 H1975细胞增殖实验筛选出高活性化合物FCN12、FCN14和FCN15,半数抑制浓度(IC50)分别为(103.33±12.10)、(115.17±7.69)和(128.63±32.72) nmol· L-1;经A431细胞增殖实验筛选出FCN12、FCN14,两者的体外抗细胞增殖抑制活性与对照药AZD9291相当(IC50＞2μmol· L-1),并可将H1975细胞阻滞于G1期;与对照药相比,FCN12、FCN14可明显增加细胞凋亡率(P＜0.01)和抑制细胞的迁移(P＜0.05),且呈浓度依赖性;体内移植瘤实验结果显示FCN12、FCN14可以明显抑制肿瘤的生长并缩小肿瘤体积(P＜0.01).结论 新型EGFR抑制剂FCN12、FCN14对EGFR耐药型NSCLC具有显著的体内外抗肿瘤活性.
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exosomes在肺癌细胞对顺铂敏感性降低过程中的作用研究
目的 研究肺癌细胞分泌的exosomes在同源细胞对顺铂的敏感性调节过程中的可能作用. 方法 采用超速离心和Exoquick-TC结合的方法从肺癌细胞系A549和H1975的上清液中分离出exosomes,透射电子显微镜观察其形态,western blot检测其CD63蛋白表达;共聚焦显微镜观察细胞胞吞exosomes过程;分别提取顺铂处理肺癌细胞来源exosomes和未处理肺癌细胞来源exosomes,并使用2种exosomes分别处理肺癌细胞,采用CCK-8法检测上述获得的exosomes对肺癌细胞顺铂敏感性的影响. 结果 透射电子显微镜下观察肺腺癌细胞来源的exosomes具有特征性的盘状结构,直径30～100 nm,western blot结果显示exosomes富舍CD63蛋白;显微镜下可观察到exosomes可进入细胞;同时经顺铂处理过肺癌细胞分泌的exosomes可降低同源细胞对顺铂的敏感性.结论 减少exosomes的分泌和传递可能会增加顺铂化疗的疗效,这为肺癌的治疗提供了一种新的思路.
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吉非替尼对肺癌细胞株A549和H1975放射敏感度的影响及其机制
目的 本研究旨在探讨小分子表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼是否能增加肺癌细胞株A549和H1975的放疗敏感度及其机制.方法 选取两种非小细胞肺癌细胞株A549和H1975,分为单纯X线组和X线+吉非替尼组.单纯X线组采用单纯X线照射,X线+吉非替尼组经10 μmol/L吉非替尼作用24 h后行X线照射.两株细胞不同分组细胞,采用克隆形成实验检测放射敏感度,免疫荧光激光共聚焦显微镜观察X线照射后不同时间点细胞核中磷酸化H2AX(γ-H2AX)亮点在细胞中的定位情况,Western blot法检测放疗后胞质胞核蛋白中EGFR的表达.结果 克隆形成实验中,A549细胞X线+吉非替尼组在各放疗剂量点的SF2值(0.3475)低于单纯X线组(0.4833);H1975细胞X线+吉非替尼组与单纯X线组在各放疗剂量点的SF2值分别为0.3094和0.3207,无明显差异.免疫荧光结果显示,照射4 Gy后各时间点X线+吉非替尼组A549细胞核中γ-H2AX亮点相比单纯X线多;单纯X线组和X线+吉非替尼组H1975细胞γ-H2AX亮点在各时间点无明显差异;Western blot结果显示,A549细胞经4Gy照射后EGFR有入核现象,而预先经吉非替尼处理再接受4Gy照射,EGFR蛋白绝大部分位于细胞质内;H1975细胞,单纯X线组和X线+吉非替尼组EGFR蛋白均在细胞质中表达,胞核中几乎没有,且两组无明显差异.结论 吉非替尼能增加肺癌细胞株A549的放射敏感度,可能与阻止放疗后EGFR入核进行双链断裂(double strand break,DSB)修复有关;对H1975细胞无影响,与其放疗后EGFR不入核相关.
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阿法替尼与PF-04691502单用及联合对H1975细胞体外抗肿瘤作用研究
目的 研究Pan-HER不可逆抑制剂阿法替尼(Afatinib)和磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)α抑制剂PF-04691502 (PF)单用及联合对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂耐药的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株H1975的体外抗肿瘤作用.方法 通过MTS法、细胞划痕愈合实验、流式细胞术检测细胞周期和凋亡分析Afatinib和PF单药及联合对耐药性非小细胞肺癌细胞株H1975增殖、迁移等的影响.结果 Afatinib和PF单用对H1975细胞增殖有明显抑制作用,且抑制作用随浓度增加而加强;Afatinib和PF联合时对H1975细胞增殖、迁移均有明显协同抑制作用;Afatinib和PF单药和联合作用均主要使细胞阻滞在G1期(P＜0.05);Afatinib和PF单用时较对照组的细胞凋亡率增加,且当两者联合作用时凋亡率增加更显著(P＜0.05).结论 Pan-HER不可逆抑制剂Afatinib和PI3Kα抑制剂PF-04691502 (PF)单用对耐药性非小细胞肺癌细胞株H1975有较强抑制作用,且当Afatinib和PF联合时对非小细胞肺癌细胞株H1975有协同抑制作用.
关键词： Pan-HER抑制剂 PI3Kα抑制剂 H1975细胞 T790M突变 联合作用 -
阿司匹林联合奥希替尼对H1975细胞的影响
目的 探讨阿司匹林联合表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂(Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor,EGFR-TKI)奥希替尼(AZD9291)对非小细胞肺癌H1975细胞株增殖的抑制作用和凋亡的影响.方法 MTT法检测阿司匹林和AZD9291单独及联合作用于肺癌细胞系H1975的吸光度值,计算细胞的增殖抑制率;荧光倒置显微镜观察Hoechst33342染色的细胞核的形态学改变;流式细胞技术检测阿司匹林和AZD9291单独及联合对H1975细胞凋亡的影响,计算细胞的凋亡率.结果 MTT结果显示阿司匹林和AZD9291单独及联合应用对H1975细胞均有抑制作用,并呈剂量依赖性.实验组与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05),联合用药组对细胞的增殖抑制具有协同作用(Q＞1.15);荧光倒置显微镜下观察发现联合用药组镜下可见大量凋亡小体,细胞核呈致密浓染;流式细胞仪检测发现阿司匹林和AZD9291单独及联合用药均能诱导细胞凋亡,且联合用药具有协同作用.结论 阿司匹林联合AZD9291对非小细胞肺癌H1975细胞株的增殖具有协同抑制作用并可诱导细胞凋亡,为临床联合用药及防治非小细胞肺癌的有效方案提供理论依据.
