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Nurr-1对小胶质细胞微环境的影响
目的:探讨Nurr-1基因对小胶质细胞活化状态及其微环境的影响.方法:分离培养新生SD大鼠小胶质细胞,纯化、鉴定并分别用脂多糖(LPS)刺激活化和过表达Nurr1基因.实验随机分为小胶质细胞组、Nurr1过表达组、LPS处理组、Nurr1过表达+LPS处理组.ELISA分析过表达Nurr1基因对不同状态小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1等炎症相关因子和BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的影响.结果:(1)小胶质细胞混合培养、纯化、CD11 b/c免疫细胞化学鉴定为阳性,纯度在＞95％;(2)Nurr1基因过表达小胶质细胞转染阳性率＞90％;(3)ELISA法检测结果显示:过表达Nurr1基因的小胶质细胞显著降低了TNF-α、IL-1的分泌,并促使了BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的分泌.结论:Nurr1基因可抑制小胶质细胞的活化和减少炎症相关因子的产生,同时可促进GDNF、BDNF、PDNF等与DA能神经元存活和成熟等相关的神经营养因子的分泌.
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6-OHDA诱导过表达Nurr1基因的SK-N-SH细胞凋亡的机制研究
为了探讨过表达外源性Nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞经6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导凋亡的机制,本实验比较了自身不表达Nurr1基因的SK-N-SH细胞和过表达外源性Nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞经6-OHDA作用后的生化改变.经75μmol/L 6-OHDA作用6～24 h,rhodamine123染色后,激光扫描共聚焦显微镜检测两株细胞线粒体膜电位(△ψm)变化,用Western blot方法检测两株细胞凋亡因子caspase-3活性前体蛋白的表达水平.结果表明,经6-OHDA作用,两株细胞△ψm均先上升后下降,但在12～24 h,SK-N-SH细胞△ψm下降显著低于SK-N-SH/Nurr1细胞(P＜0.001);75μmol/L 6-OHDA作用6～24 h,SK-N-SH/Nurr1细胞caspase-3活性前体蛋白表达水平显著下降(P＜0.∞1),而SK-N-SH细胞caspase-3前体蛋白表达变化不明显.以上结果提示,6-OHDA诱导SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡可能与激活caspase-3有关,而6-OHDA诱导SK-N-SH细胞毒性损伤与线粒体膜电位显著下降有关.
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人Nurr1基因克隆及其在真核细胞中的表达
为探讨Nurr1基因治疗Parkinson病的可行性,本研究克隆了中国人核相关受体1(nuclear related receptor 1,Nurr1)基因,并重组携带Nurr1基因的真核表达载体,为该研究提供分子生物学基础.实验采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从人胎儿脑中获取Nurr1 cDNA,将其克隆至pGEM-T Easy载体中;测序鉴定后,重组携带Nurr1基因的逆转录病毒载体pLNCX2-Nurr1;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH 313细胞系以检测病毒滴度.结果发现,RT-PCR扩增得到人Nurr1 cDNA片段,序列与GenBank登录的序列一致;将Nurr1基因亚克隆至逆转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLNCX2-Nurr1,病毒上清滴度为2×105 CFU/ml.结果表明本实验获得人Nurr1基因cDNA序列,检测到Nurr1基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清.
关键词： Nurr1 基因克隆 基因表达 Parkinson病
