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王枣子总黄酮影响佐剂性关节炎大鼠病理的分子机制研究
课题组前期研究发现宿州地方特色药材王枣子中总黄酮(total flavonoids of Isodon amethystoides,TFIA)对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)具有一定的治疗作用,并且这种治疗作用可能是通过对miR-152表达的上调实现的,该文进一步研究TFIA对AA大鼠病理机制影响的分子机制.采用完全弗氏佐剂制备AA大鼠,TFIA灌胃治疗,采用Real-time qPCR检测TFIA灌胃治疗对AA大鼠关节滑膜成纤维样滑膜细胞(fibroblast like synoviocytes,FLS)中miR-152、甲基化酶DNMT1及甲基化结合蛋白MeCP2构成的负调控环路的影响,对miR-152下游经典Wnt信号通路的影响,对AA大鼠病理基因fibronectin表达的影响.TFIA灌胃治疗显著抑制DNMT1表达,逆转了AA大鼠病理中存在的由miR-152,DNMT1和MeCP2构成的负调控环路,向治疗组FLS转染miR-152 inhibitors后,DNMT1表达显著恢复.TFIA灌胃治疗显著上调SFRP4表达,抑制经典Wnt信号通路关键基因β-catenin,C-myc和ccnd1表达,显著抑制AA病理基因fibronectin表达,向治疗组FLS转染miR-152 inhibitors后,逆转了TFIA灌胃治疗对SFRP4,β-catenin,C-myc,ccnd1和fibronectin表达的影响.TFIA可能通过miR-152表达的上调抑制DNMT1表达,上调SFRP4表达,抑制经典Wnt信号关节基因β-catenin,C-myc,ccnd1表达,抑制RA基因fibronectin表达.
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经典Wnt信号通路调控对大鼠心肌梗死后心肌愈合的影响
目的 探讨经典Wnt信号通路对大鼠心肌梗死后心肌组织愈合的影响.方法 建立大鼠急性心肌梗死模型,采用免疫组化和实时荧光定量PCR技术检测经典Wnt信号通路中的两个关键信号分子Wnt-1、β-catenin蛋白及mRNA在对照组(C组)、梗死组(Ⅰ组)和非梗死组(N组)各时间点心肌组织中的时空表达;同时观察心肌梗死后心肌组织的病理学变化.结果 各时间点心肌组织中Wnt-1、β-catenin的表达水平在C组与N组中无显著性差异.Ⅰ组4天、7天、10天、14天心肌组织中Wnt-1、β-catenin的蛋白表达水平较C组、N组明显增高(P<0.01);Ⅰ组1天、4天、7天、10天、14天心肌组织中Wnt-1、β-catenin的mRNA表达水平较C组、N组明显增高(P<0.01);且动态变化与心肌梗死后心肌的愈合过程相平行.通过病理形态学与免疫组化分析发现肌纤维母细胞、内皮细胞在发生梗死的大鼠心脏中增殖和迁移的过程中伴随着Wnt-1、β-catenin的高表达.结论 经典Wnt信号通路参与心肌梗死后心肌组织的修复和愈合过程;并对肌纤维母细胞和血管内皮细胞的增殖、迁移起一定的调控作用.
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股骨颈骨折患者围术期血清骨硬化蛋白及Dickkopf-1蛋白水平变化规律及意义
目的 探讨股骨颈骨折患者围术期血清骨硬化蛋白(SOST)和Dickkopf-1(Dkk-1)蛋白的变化规律及临床意义.方法 选择2014年8月～2015年8月于南京大学医学院附属鼓楼医院行股骨颈骨折关节置换术患者45例为实验组,采集患者术前1d及术后1、3、5d空腹静脉血样;选择同期45例年龄、性别、体重指数配对的健康体检者作为对照组.检测两组患者血清中SOST和Dkk-1水平并进行分析.结果 实验组患者术前血清SOST为1.3(1,2.39)ng/mL,Dkk-1为(2.87±1.08)ng/mL,明显低于照组[SOST为1.95(1.64,2.64)ng/mL,Dkk-1为(3.66±1.21)ng/mL](P＜ 0.01).实验组患者围术期血清SOST与Dkk-1均呈先升高后下降的趋势,且两者呈正相关(P＜0.05).血清SOST在术后1d迅速升高至1.49(1.07,1.99) ng/mL,术后3d降至1.3(0.97,2.1)ng/mL,术后5d迅速降至1.01 (0.91,1.55) ng/mL,与术前比较差异均有统计学意义(P＜0.05).血清Dkk-1在术后1d显著升高至(3.04±1.04)ng/mL,术后3d升至(3.07±1.19)ng/mL,术后5d降至(2.93± 1.08)ng/mL,但术后3、5d值与术前比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 围术期股骨颈骨折关节置换术患者血清SOST与Dkk-1均呈先升高后下降的趋势.血清SOST术后变化较DKK-1更敏感,趋势更显著,可作为骨折后机体成骨能力的标志物及潜在的药物治疗靶点.
关键词： 股骨颈骨折 骨硬化蛋白 Dickkopf-1 经典Wnt信号通路 -
经典Wnt信号通路对细胞成骨分化的调控作用
Wnt信号通路是参与体内多种器官发育和组织新陈代谢的保守性通路,可分为经典和非经典Wnt信号通路.其中,经典Wnt信号通路通过调节下游的成骨相关转录因子调控细胞成骨分化、骨基质形成和矿化,且在细胞分化的不同阶段发挥不同的调控作用.此外,经典Wnt信号通路还调控牙周组织干细胞成骨分化,该作用受外界微环境的影响.加深对经典Wnt信号通路的认识有助于治疗相关的骨疾病.
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Wnt/β-catenin信号通路及其对骨髓间充质干细胞多向分化调节研究进展
Wnt/β-catenin信号通路(经典Wnt信号通路)作为调节细胞生长和分化的重要信号途径一直是医学研究的重点.近年研究表明,在骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞定向分化的过程中经典Wnt信号传导通路发挥着重要的调控作用,其调控机制已经成为骨组织工程学研究的热点,同时也为骨代谢疾病的治疗提供了新的思路和手段.文章集中近几年经典Wnt信号传导通路的研究成果,从经典Wnt信号通路的组成、信号传导途径、对骨髓间充质干细胞多向分化的调控等方面进行综述.
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正常大鼠的骨髓间充质干细胞对去势大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响
目的:为研究正常大鼠的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)分泌的细胞因子对去势后大鼠的骨髓间充质干细胞BMMSCs成骨成脂分化能力的影响及机制.方法:12只雌性SD大鼠随机分为假手术(sham)组,去势(ovx)组.建立sham和ovx模型.术后2个月取sham组和ovx组大鼠BMMSCs,分为sham(A)组、ovx(B)组、ovx细胞+ sham培养液(C)组、sham细胞+ovx培养液(D)组进行间接共培养,RT-PCR检测各组BMMSCs成骨成脂相关基因;Western blot检测各组BMMSCs成骨成脂相关蛋白;Western blot检测Wnt经典信号通路相关蛋白.油红染色;茜素红染色.结果:成骨相关基因及蛋白表达以及Wnt经典通路的相关蛋白β-catenin和active-β-catenin组明显高于B组,D组低于A组;成脂相关基因及蛋白表达C组明显低于B组,D组高于A组.油红染色、茜素红染色结果与基因、蛋白的结果相一致.结论:正常大鼠BMMSCs分泌的细胞因子能够通过激活Wnt经典信号通路促进ovx大鼠BMMSCs的成骨分化并抑制其成脂分化.
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经典Wnt信号通路在2型糖尿病小鼠周围神经病变中的作用机制研究
目的 探讨经典Wnt信号通路在糖尿病周围神经病变中的作用机制.方法 C57BL6小鼠采用随机数字表法分为3组,1组以正常饮食作为基础对照组( Chow-NC组),其余2组通过60%脂肪含量饲料喂养联合小剂量注射链脲佐菌素的方法,构建2型糖尿病小鼠模型,造模成功后分别腹腔注射Wnt信号通路抑制剂和磷酸盐缓冲液(PBS),为糖尿病模型鼠+XAV 939组(T2DM-XAV 939组)和糖尿病模型鼠+PBS对照组(T2DM-PBS组). 3组小鼠均以第21周为实验终点,测定小鼠空腹血糖、血清胰岛素含量,计算稳态模型评估的胰岛素抵抗指数( HOMA-IR),测定足底热刺痛反应及运动耐力,检测经典Wnt信号通路相关基因的表达水平.结果 第21周时T2DM-XAV 939组的总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、HOMA-IR均高于T2DM-PBS组,但差异无统计学意义,谷草转氨酶活力下降( P＜0. 05);与 T2DM-PBS 组相比, T2DM-XAV 939组的小鼠肝重/体重比值较高(P＜0.05);足底热刺痛反应时间较长、运动耐力差(P＜0.05);T2DM-XAV 939组小鼠胰岛素受体底物2(IRS-2)mRNA的表达水平较低(P＜0.05).此外,该组经典Wnt信号通路相关基因β-catenin、c-myc、线粒体转录因子A(TFAM)mRNA的表达水平低于T2DM-PBS组,但差异无统计学意义. c-myc蛋白表达量低于T2DM-PBS组(P＜0.05).随着实验进展,本研究发现T2DM-XAV 939组小鼠的生存率与其他2组相比,明显降低.结论 经典Wnt信号通路受到抑制后可能会加重糖尿病小鼠的周围神经病变.
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经典Wnt信号通路与精神分裂症
精神分裂症是一种重性精神病性障碍,病因和机制尚未明确,但目前普遍认为是由多个微效基因协同并与环境因素共同作用导致的疾病.由多基因组成的信号通路及通路间的相互作用在精神分裂症发病中可能起重要作用.与中枢神经系统发育和功能维持密切相关的经典Wnt信号通路近年来受到较多关注.许多针对Wnt信号通路与精神分裂症的关联研究均表明,精神分裂症患者细胞内Wnt信号通路异常.文章就目前针对经典Wnt信号通路在精神分裂症发病中潜在作用的相关研究作一综述.
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经典Wnt信号通路对少突胶质前体细胞生长发育的调控
少突胶质前体细胞(OPCs)经历增殖、迁移、分化为成熟少突胶质细胞(OLs),包绕轴突形成髓鞘,维持轴突正常功能及神经冲动传导.OPCs的生长发育受多种信号分子及通路的影响,其中经典Wnt信号通路与OPCs正常及病理状态下的增殖、迁移和分化过程密切相关,通路中相关分子的变化导致该通路的活化均会影响OPCs的发育,进而影响髓鞘的形成与修复再生.
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Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞CXCR4表达的调控作用
目的 研究经典Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs) CXCR4表达的影响,探索Wnt通路调节干细胞迁移的可能机制.方法 培养雄性SD大鼠BMSCs,对所培养的细胞进行鉴定;通过反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)探讨活化/阻断Wnt信号通路对BMSCs表达CXCR4的影响.结果 ①BMSCs的体外培养及鉴定:细胞呈梭形,漩涡状排列,放射状生长.细胞表面标志CD29(+)、CD90(+)、CD45(-),能定向诱导细胞表达神经细胞标记物,体外能分化为脂肪细胞,符合BMSCs表面标记物表达及多向分化潜能特征.②应用200 ng/ml的Wnt3a作用24 h即可以充分激活经典Wnt信号通路,应用100 ng/ml的DKK-1作用24 h可以充分阻断经典Wnt信号通路.③阻断经典Wnt信号通路可以促进体外培养的BMSCs的CXCR4的表达;激活经典Wnt信号通路可以抑制体外培养的BMSCs的CXCR4的表达.结论 干预Wnt信号通路可以调控BMSCs CXCR4表达,经典Wnt信号通路有望通过CXCR4/SDF-1通路调控BMSCs向组织的迁移.
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Wnt信号通路抑制剂Dkk-1与颞叶癫痫的关系研究进展
Wnt信号通路在调节胚胎期神经发育、神经发生、神经元分化、稳态维持中有比较重要的作用.脊椎动物中发现的分泌蛋白Dickkof-1 (Dkk-1)作为经典Wnt/β-catenin的抑制剂,与多种疾病的病理生理相关,如阿尔茨海默病、颞叶癫痫(TLE)、缺血性脑损伤、癌症、骨病等.近年来发现,在海人酸(KA)诱导癫痫模型中、TLE患者的海马组织中以及与癫痫等疾病相关的神经兴奋性毒性模型中,均有Dkk-1表达水平的改变,证明Dkk-1参与癫痫后的神经元变性的病理生理过程.本文就Wnt信号抑制剂Dkk-1与TLE的关系研究进展进行综述.
关键词： 颞叶癫痫 经典Wnt信号通路 Dickkopf-1 -
银杏叶提取物对成骨细胞分化的影响及相关机制研究
目的:探讨银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)对成骨细胞分化的影响及其可能的相关分子机制.方法:将不同浓度的GBE作用于MG63,通过茜素红染色及碱性磷酸酶(ALP)活性检测判定其对细胞成骨分化能力的影响.RT-PCR检测Runx2 (runt-related transcriptionfactor 2)、一型胶原蛋白(COL1A1)、骨钙素(Osteocalcin,OC)及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达,Western Blot检测细胞核蛋白β-catenin及cyclinD1的表达.结果:不同浓度的GBE能提高ALP活性及钙结节数量,在浓度为75 mg/L时为显著;此外,GBE能显著提高Runx2、COL1A1、OC、cyclinD1的mRNA表达及cyclinD1的蛋白表达,同时促进β-catenin蛋白的核内转移;而上述活性均能被DKK1所抑制.结论:银杏叶提取物对成骨细胞的分化具有积极意义,其机制可能与经典Wnt通路的激活有关.
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RSPO4和乳腺癌细胞经典Wnt信号通路相关性研究
目的:探讨R-spondin4 (RSPO4)对乳腺癌经典Wnt信号通路影响.方法:以0,10,50,250 ng·mL-1不同质量浓度RSPO4处理乳腺癌细胞株MDA-MB-231和HS578T 24 h,运用荧光素酶报告基因技术分析其对β-连环蛋白(β-catenin)/TCF转录活性影响;同时运用谷胱甘肽转移酶-E-钙黏蛋白(GST-E-cadherin)结合法提取胞浆游离β-catenin,Western blot法测定总β-catenin、胞浆游离β-catenin、低密度脂蛋白相关受体-6 (LRP6)及磷酸化LRP6 (p-LRP6)及Axin2蛋白水平.结果:RSPO4可明显增强乳腺癌细胞株MDA-MB-231和HS578T的TOP flash活性,升高p-LRP6、胞浆游离β-catenin、Axin2蛋白水平,并呈现剂量依赖性.结论:RSPO4可激活乳腺癌细胞经典Wnt信号通路.
关键词： RSPO4 低密度脂蛋白相关受体-6 经典Wnt信号通路 乳腺癌 -
LRP6受体胞内区赖氨酸位点突变和经典Wnt信号通路相关性分析
目的:探讨LRP6受体胞内区赖氨酸位点突变对经典Wnt信号通路影响.方法:构建胞内区3个赖氨酸位点(K8R、K48R及K82R)同时突变的突变型LRP6受体,瞬时转染HEK293细胞,运用荧光素酶报告基因技术分析其对β-catenin/TCF转录活性影响;同时运用谷胱甘肽转移酶-E-钙粘蛋白(GST-E-cadherin)结合法提取胞浆游离β-连环蛋白(β-catenin),Western blot法测定总β-连环蛋白、胞浆游离β-连环蛋白、低密度脂蛋白相关受体-6(LRP6)及磷酸化LRP6(p-LRP6)蛋白水平.结果:和转染空白质粒PcDNA3比较,转染LRP6增强TOPflash活性593倍(P＜0.05),提高胞浆游离β-catenin水平126.3％;而转染赖氨酸突变的LRP6将进一步增强TOPflash活性,达2 989倍(P＜0.05),胞浆游离β-catenin水平提高580.5％;和转染未突变LRP6相比,转染胞内区赖氨酸突变LRP6受体激活Wnt信号通路作用更强.结论:LRP6胞内区赖氨酸位点在LRP6参与Wnt信号通路活化过程中可能具有重要作用.
关键词： 赖氨酸残基 低密度脂蛋白相关受体-6 经典Wnt信号通路 突变 -
粗糠柴毒素对前列腺癌细胞经典Wnt信号通路影响
目的:探讨粗糠柴毒素(Rottlerin)对前列腺癌细胞PC-3经典Wnt信号通路作用.方法:以不同浓度Rottlerin处理PG-3细胞24 h,谷胱甘肽转移酶E-钙粘蛋白(GST-E-cadherin)结合法提取胞浆游离β-连环蛋白(β-catenin),Western blot法测定总β-连环蛋白、胞浆游离β-连环蛋白、低密度脂蛋白相关受体-6(LRP6)及磷酸化LRP6(p-LRP6)蛋白水平.结果:Rot-tlerin可明显降低PC-3胞浆游离β-连环蛋白水平、LRP6及p-LRP6蛋白水平,并成剂量依赖性,和对照组比较,Rottlerin0.25、0.5、1.0和2.0μmol· L-1组胞浆游离β-连环蛋白水平分别下降54.0％,78.6％,79.7％和79.6％,LRP6表达分别下降17.9％,38.8％,63.2％和85.0％,p-LRP6水平分别下降29.4％,67.1％,96.3％和97.4％.结论:Rottlerin可通过LRP6受体抑制PC-3细胞经典Wnt信号通路.
关键词： 粗糠柴毒素 低密度脂蛋白相关受体-6 经典Wnt信号通路 -
经典Wnt信号通路在心脏瓣膜发育中的作用
心脏瓣膜的形成是脊椎动物心脏发育过程中的重要环节。心脏瓣膜的发育异常会导致心功能不全，是人类先天性心脏病的常见表征之一。经典Wnt信号通路在心脏发育的不同时期分别作用于心肌细胞、心内皮细胞以及瓣膜原基细胞的增殖、分化和迁移过程，并调控心内膜垫形成过程中的内皮-间充质细胞转化（EndMT）过程，具有多面性和时效性。该文将总结经典Wnt信号通路在心脏瓣膜发育领域的新研究进展，分别阐述经典Wnt信号通路在不同瓣膜发育阶段中的功能变化，并展示经典Wnt信号通路与其他瓣膜发育相关的信号通路及表观遗传修饰间的相互关系，后分析心脏发育后期Wnt信号通路对瓣膜间充质干细胞发挥潜在功能的作用。
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2型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞中Dickkopf-1蛋白的表达水平及其与成骨活性的关系
目的:检测2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)生长活性及成骨分化能力,以及Dickkopf-1 (DKK-1)蛋白在BMSCs诱导成骨过程中的表达水平,探讨T2DM对BMSCs成骨活性的影响及其与DKK-1表达的关系.方法:提取并分离T2DM造模大鼠BMSCs,进行体外培养与成骨诱导,并将其分为T2DM组和正常对照组;采用细胞计数试剂盒检测BMSCs增殖活性;采用膜联蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化吡啶(propidium iodide,PI)双染法检测细胞凋亡率;采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测试剂盒检测BMSCs中ALP表达水平;采用茜素红染色与矿化结节定量法分析BMSCs成骨分化程度;采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)法检测大鼠BMSCs中核心结合因子a1(core binding factor alphal 1,Runx2)和DKK-1的表达.结果:T2DM组大鼠BMSCs增殖活性比正常对照组弱,细胞凋亡增加(均P＜0.01);BMSCs成骨诱导过程中,T2DM组大鼠ALP表达量比正常对照组显著降低,且钙结节形成减少,Runx2表达下调(均P＜0.01);T2DM组BMSCs中DKK-1蛋白和mRNA表达上调,高于正常对照组(均P＜0.01);DKK-1蛋白和mRNA表达与Runx2的表达升高有关(均P＜0.01).结论:T2DM造模大鼠BMSCs的生长活性及成骨分化潜能受损,这可能与BMSCs中DKK-1表达升高有关.
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辛伐他汀对大鼠成骨细胞经典Wnt信号通路相关因子表达的影响
目的：观察不同浓度、不同时间辛伐他汀对体外培养的大鼠成骨细胞经典Wnt通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表达的影响，探讨辛伐他汀抗骨质疏松的可能机制。方法用酶消化法培养大鼠颅骨成骨细胞，采用倒置相差显微镜及碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察和鉴定成骨细胞。用浓度分别为10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L和10-5 mol/L的辛伐他汀干预大鼠成骨细胞24 h、48 h和72 h，并设无辛伐他汀为对照组，采用RT-PCR检测经典Wnt信号通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表达情况。结果镜下观察及染色结果均显示具有成骨细胞典型特征。RT-PCR结果显示：10-5 mol/L辛伐他汀组干预24 h后较对照组Wnt3a [(2.09±0.12) vs (1.82±0.09)]、LRP5[(1.42±0.07) vs (1.29±0.07)]和β-catenin [(1.10±0.06) vs (0.95±0.06)]的mRNA表达显著增加；干预48 h和72 h后各组Wnt3a (F=37.78和96.52，P=0.000)、LRP5(F=10.32，P=0.001和F=22.02，P=0.000）的mRNA表达随着辛伐他汀浓度的增大而显著增加，β-catenin的mRNA表达较对照组显著增加(F=6.67和21.90，P<0.05)；10-8~10-5 mol/L辛伐他汀各组中分别干预24 h、48 h和72 h，随着干预时间延长Wnt3a和LRP5的mRNA表达均增加；干预48 h与24 h比较，β-catenin的mRNA表达差异无统计学意义[(1.08±0.09) vs (1.02±0.06)，P>0.05]，而干预72 h较24 h显著增加[(1.23±0.10) vs (1.02±0.06)，P<0.05]，且辛伐他汀浓度为10-6 mol/L和10-5 mol/L干预72 h较48 h显著增加[(1.32±0.07) vs (1.11±0.05)和(1.47±0.08) vs (1.19±0.04)，P<0.05]。结论辛伐他汀可促进体外培养大鼠成骨细胞经典Wnt信号通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表达。
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Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响
目的:探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetie protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响.方法:以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路.检测各处理组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化、钙盐沉积、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥素(osteopontin,OPN)变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响.结果:BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性(F=1 467.21,P=0.000)、钙盐沉积、OC(F=32.95,P=0.000)和OPN(F=127.23,P=0.000)蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟.结论:Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与.
