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展望CRISPR/Cas9基因编辑技术在药用植物研究中的应用
CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发现的一种基因组定点编辑技术,该技术已经广泛应用在基因治疗、基因功能研究、动物模型制造、农作物品种改良等领域的研究中.该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术,并提出了这项技术在药用植物功能基因组学研究、活性成分次生代谢及合成生物学研究、药用植物分子育种研究等方面的应用前景,为开辟药用植物新领域的研究提供了参考.
关键词： 药用植物 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 -
基因编辑技术的研究进展及其在中药研究中的前景展望
基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术,可对特定DNA片段进行敲除、加入和替换等,从而在基因组水平上进行精确的基因编辑.其技术本质均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复,联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变.基因编辑技术在科研、农业、医疗等领域都具有极其广泛的发展前景和应用价值.在疾病基因治疗领域,基因编辑技术在癌症如白血病、遗传性疾病如血友病、地中海贫血、多种肌肉营养障碍症和逆转录病毒相关传染病如艾滋病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩:结合基因编辑技术开展的实验新方法学研究及动物模型的制备工作也在迅猛地发展和完善;世界各地的实验室也已将基因编辑技术应用于预防疟疾、器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活等多个研究领域.该文就基因编辑技术在上述领域中的研究进展进行一些概括和总结.此外还归纳了一些当前针对基因编辑技术存在的争议和思考,并初步探讨了该技术在中药研究中的潜在应用前景.
关键词： 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 ZFNs TALENs -
双酶切法构建CRISPR-Cas9载体系统的研究
目的 以pet41a质粒为载体骨架,通过酶切连接法构建crispr-cas9载体系统,建立一种简单有效的基因编辑载体,为研究细菌耐药基因的敲除提供方法. 方法 选择质粒pet41a、pwt-cas9和pgRNA,分析核酸序列,选择合适酶切位点.使用XhoⅠ和BgiⅡ两种限制性内切酶分别酶切pet41a和pwt-cas9,形成带有相同粘性末端的线性载体片段,回收并用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-cas9.使用BgiⅡ和XbaⅠ两种限制性内切酶分别酶切pet41-cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-cas9-gRNA.分别将重组质粒pet41-cas9和pet41 a-cas9-gRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析. 结果 测序证实质粒pet41-cas9、pet4 1a-cas9-gRNA连接正确,载体构建成功.重组质粒粒转染DE3后经IPTG诱导4h,表达相对分子质量为160×103的重组蛋白,与cas9蛋白理论分子质量相符. 结论 成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41a-cas9-gRNA并表达重组cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了实验基础.
关键词： 基因编辑技术 CRISPR-Cas9 载体构建 限制性内切酶 -
CRISPR/Cas基因编辑技术应用于表皮生长因子受体突变型肺腺癌的治疗
CRISPR/Cas基因编辑技术是一种强大的新技术,可以精确编辑细胞基因组.该技术在实验室应用的基础上,引入至肿瘤研究领域,成为目前肿瘤治疗研究领域的热点.肺癌的综合治疗已经进入了分子靶向时代,表皮生长因子受体(epi-dermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是肺腺癌主要、重要的驱动基因之一,表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosinekinase inhibitors,EGFR-TKI)治疗EGFR突变肺腺癌有显著疗效,但随之而来的原发性和继发性耐药现象成为当前迫切需要解决的问题.应用CRISPR/Cas基因组编辑技术进行个性化分子手术可有效地纠正或破坏EGFR突变,从而抑制肿瘤生长和进展.随着CRISPR/Cas基因重组技术的日臻完善与成熟,分子手术方法联合传统外科手术、放疗和/或TKI靶向药物治疗必将为携带EGFR突变的肺腺癌患者带来很好的希望.
关键词： CRISPR/Cas 基因编辑技术 表皮生长因子受体 肺癌 -
CRISPR/Cas9系统在现代生物学研究和临床试验中的应用
规律成簇间隔短回文重复结构(clustered regularly interspaeed short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protien 9,Cas9)系统在生物医学研究中被广泛应用于基因编辑及探索基因的功能.这种基因编辑技术越来越多地运用在人类疾病的治疗中,包括巴斯综合征、杜氏肌萎缩症、血友病、地中海贫血和囊性纤维化.CRISPR/Cas 9基因编辑系统可以在体外细胞实验和体内动物实验上修复突变的DNA序列,也能改变CCR5、PD-1/L1、CAR-T等基因序列,用于控制HIV病毒的入侵及提高肿瘤免疫治疗的疗效.该技术还被运用于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)分化,形成某些具有功能的器官用于器官移植.本文综述了CRISPR/Cas 9系统的来源、结构和作用原理,以及其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用.
关键词： CRISPR/Cas 9系统 基因编辑技术 基因治疗 -
基因编辑技术(CRISPR-Cas9)在医学领域的应用及其相关伦理问题思考
近期,运用CRISPR基因编辑技术修饰人类胚胎基因,以及基因编辑婴儿事件的出现,引发了学术界以及整个社会对基因编辑技术应用以及伦理问题的争议.本文从CRISPR技术的原理,及其在医学上的应用等各方面简述了基因编辑技术的发展现状及存在的问题.同时,通过分析基因编辑婴儿事件,反思了此项技术应用产生的伦理争议及其可能产生的后果,并提供了解决伦理问题的几点对策.
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用CRISPR/Cas9系统消除潜伏的HIV前病毒基因组及其感染细胞的研究进展
艾滋病在全球采用联合抗逆转录病毒治疗后发病率及死亡率呈持续下降趋势,使之成为一种可管理的慢性传染病.但因受各种因素制约,艾滋病仍然是全球一个重要公共卫生问题.HIV/AIDS 持续存在的主要原因是现有的治疗无法清除人体中存在的 HIV潜伏库,由于这种库的存在,HIV/AIDS患者必须终生使用抗病毒药物来抑制病毒复制和反弹.成簇规律间隔短回文重复序列和相关核酸酶Cas9(CRISPR/Cas9)系统几年前以一种简单、快速及易操作的基因编辑技术问世,多项研究表明其在 HIV感染的细胞和在动物模型实验中具有消除或破坏 HIV储存库或 HIV感染细胞的潜力,可能由此产生治愈 HIV/AIDS的方法.本文分析了CRISPR/CAS9系统应用于消除潜伏 HIV的结果,并对可能产生的问题和趋势进行了讨论.
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术在眼科疾病研究中的应用
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA.随着技术的不断进展,研究者发现CRISPR/Cas9技术可用于靶向插入、替换或敲除真核细胞基因.研究者运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,发现了PAX6在角膜中的过度表达可导致先天性角膜上皮损伤,进一步加深了关于KRT12突变对Meesmann角膜上皮营养不良的致病机制的研究.研究还发现PAX6可通过对GJA8基因以及αA晶状体基因的敲除来进行先天性白内障动物模型的构建,有利于未来应用于先天性白内障的鉴别和病理分析.此外,研究者应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进一步证实了RHOS334基因突变的RHO等位基因、P23H突变的RHO基因、Y347X突变的Pde6b基因以及突变型RP9等位基因与视网膜色素变性的相关性,为突变型KCNJ13基因、突变型CEP290基因与Leber先天性黑矇的相关性提供了证据支持.利用该技术对VEGFR2基因以及TXNIP基因进行基因编辑可为眼内新生血管疾病提供新的治疗靶点,同时该技术在增生性玻璃体视网膜病变以及视网膜母细胞瘤的致病基因研究和动物模型构建中也发挥了重要的作用.本文对CRISPR/Cas9基因组编辑工具酶的发展历程、分子特点和作用机制进行总结,并概述了当前CRISPR/Cas9技术在眼科疾病研究中的进展及应用.
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑技术 眼科疾病 疾病动物模型 基因疗法 -
CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术治疗神经肌肉单基因病的研究现状
神经肌肉单基因病是目前常见也严重的单基因遗传病之一.基因编辑技术,具有治疗包括神经肌肉单基因病在内的许多单基因病的临床潜力.本文主要总结已发表的基因编辑技术在神经肌肉单基因遗传病治疗中的文章,并对其安全性进行简要分析,以期为今后的进一步实验提供参考.
关键词： 神经肌肉单基因病 单基因遗传病 基因编辑技术 安全性 CRISPR/Cas9 -
利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响
目的:在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的mCherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响.方法:通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒pKD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达.用同样的方法,将一段随机靶标序列引入pTac-mCherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的mCherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活mCherry荧光报告质粒pQ0、pQ40、pQ80、pQ120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为pQ0组、pQ40组、pQ80组及pQ120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率.结果:PCR及测序证实pKD46-Cas质粒及插入失活的mCherry荧光报告载体pQ0、pQ40、pQ80、pQ120构建成功,Western blot鉴定pKD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示pQ0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义(P＜0.05),重组修复效率与同源片段长度呈正相关(r=0.792,P＜0.01).结论:成功建立了基于mCherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0～120 bp时其长度对重组效率有影响.此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台.
关键词： CRISPR/Cas9 同源重组修复 基因编辑技术 -
CRISPR/Cas系统在人眼相关疾病中的应用
CRISPR/Cas系统原是在细菌的免疫系统内发现的用来抵抗外源遗传物质(如噬菌体病毒)的一种防御系统.由于其精确的靶向功能,CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具,被广泛地应用于生命科学研究的各个领域,并取得了革命性的进展.本文回顾性研究相关文献中关于CRISPR/Cas系统在人眼相关疾病中的应用,并进行总结.
关键词： CRISPR/Cas系统 基因编辑技术 眼科学 -
基因编辑技术引发的医学伦理问题及对策思考
随着基因编辑技术的迅速发展和广泛应用,基因编辑技术驱动下的医学伦理问题也越来越受到科学家和医学伦理学家的关注.在详细阐述目前几大主流基因编辑技术潜在的风险与不足的基础上,分析了基因编辑技术发展中面临的主要医学伦理问题,并提出对所有基因编辑技术研究采取乐观审慎的态度,以及尽快制定针对基因编辑技术的法律法规和伦理规范等相关对策.同时,建议不同国家和地区的科学家、医学伦理学家和相关部门通力合作、资源共享,尽快制定相关法律法规和医学伦理规范,对发展迅速、应用前景广泛的基因编辑技术进行合理引导和严格监管.
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CRISPR基因魔剪助力HIV／AIDS治愈
抗逆转录病毒疗法（ ART ）通过高效抑制艾滋（ AIDS）患者体内Ⅰ型免疫缺陷病毒（ HIV?1）的复制，获得了显著的临床效果，但由于潜伏在患者体内病毒库的存在，艾滋病仍然是不治之症。近年来，基因编辑技术发展迅速，以锌指核酸酶（ZFNs）技术、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）技术和sgRNA（ single guide RNA）引导的CRISPR／Cas9技术为引人注目。利用这些基因手术刀，可以从多个途径预防病毒对体内正常细胞的感染，抑制或阻止其在体内的复制，例如对能被病毒感染的 CD4＋T 细胞的两种辅受体 CCR5和CXCR4基因进行突变，或者将整合到被感染的人体细胞中的前病毒DNA切除。其中CRISPR／Cas9技术以其强大的基因编辑和调控转录激活关闭的潜能，加之操作的易行和通用等特点，成为当前治疗艾滋病的具前景的基因编辑技术。
关键词： ART 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 人类免疫缺陷病毒 -
浅析基因编辑技术在生物医学研究中的应用与发展
随着基因编辑技术的发展,使人们从分子水平上认识到了人类疾病可以通过修改基因序列以及调控不同细胞中的基因表达.基因编辑技术在基因工程药物开发,药物模型建立以及基因治疗等一些生物领域中有着广泛的研究前景.
