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菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究
完善快速PCR鉴定检测体系,并建立菟丝子或莱菔子的分子鉴别方法.收集不同地区的菟丝子、莱菔子及其易混淆品材料,所有样品进行总DNA的提取,通过对菟丝子、莱菔子及其易混淆样品ITS片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,采用2步法进行PCR扩增,从而对菟丝子或莱菔子进行鉴别.通过对影响PCR退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪进行考察,分别获得菟丝子、莱菔子快速PCR反应程序.在稀释后的PCR产物中加入SYBR Green Ⅰ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光,且可有效的避免因引物二聚体而存在的假阳性问题.快速PCR方法可以简单快速鉴别菟丝子、莱菔子,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑.
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快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究
该研究依据哈蟆油Cyt b基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物,采用碱裂解法提取基因组DNA,2步循环 PCR 程序进行 PCR 反应,并对PCR反应条件进行优化,从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法.该方法在90 ℃变性3 s,62 ℃退火延伸20 s进行32个循环时,加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光.该方法准确、简便,40 min内即可完成鉴别,为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持.
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快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用
建立简单快速的金银花真伪分子鉴别方法.该研究依据金银花trnL-trnF 625位G/T SNP位点设计快速位点特异性PCR引物,优化位点特异性PCR条件,对金银花及其9种混淆品进行扩增及检测.当在87℃预变性1 min;87℃变性5s,68℃延伸5s,30个循环时,通过加入SYBR Green Ⅰ染料染色,金银花样品显绿色荧光,混淆品无荧光.整个PCR反应可在30 min内完成.该研究结果说明快速位点特异性PCR能简单快速鉴别金银花及其混淆品.
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快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用
为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材(乌梢蛇,金钱白花蛇,蕲蛇)真伪品的方法.该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础,采用碱裂解法提取基因组总DNA,加入特异性PCR引物,采用两步法进行PCR扩增,从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别.通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序.在PCR产物中加入SYBR Green Ⅰ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光.所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30～45 min完成,为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持.
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快速PCR检测猪链球菌2型方法的研究及应用
目的 建立可同时检测猪链球菌2型5种特异基因的快速PCR方法.方法 根据已有的5对猪链球菌2型特异基因引物,运用高效聚合酶及优化反应程序,建立针对猪链球菌2型的16s RNA基因、荚膜多糖基因(cps-2J)、溶菌酶释放蛋白相关基因(mrp)、细胞外因子基因(ef)和溶血素基因(sly)的快速PCR方法.结果 此法可在一台PCR仪上30min同时扩增猪链球菌2型的5种特异基因,敏感性和特异性与普通PCR无差别.对35株猪链球菌2型菌株的检出率为100％.结论 所建立的检测方法具有便捷、快速的优点,可应用于人畜间猪链球菌2型突发疫情的实验室快速诊断.
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食品中单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR快速检测方法的建立
目的 利用荧光定量PCR技术,建立食品中单核细胞增生李斯特菌污染的快速敏感特异的检测方法.方法 以单核细胞增生李斯特菌的-hlyA基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以单核细胞增生李斯特菌菌株,提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和退火温度,以单核细胞增生李斯特菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性.并初步应用于样品的检测.结果 本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8μmol/L,0.6μmol/L,退火温度为60℃时,具有良好的特异性和敏感性.在10株相关菌株的检测中,除单核细胞增生李斯特菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性.在纯菌条件下,定量检测低限19cfu/ml.稳定性分析表明:同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5%.检测样品结果显示Real-time PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便.结论 该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值.
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基于快速PCR方法的人参属药用植物鉴别研究
目的:建立一种准确、快速、高效鉴别人参属药用植物的分子鉴别方法.方法:采集不同产地的人参、西洋参及同属近缘种植物,所有样品进行总DNA的提取并使用matK片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计西洋参特异性鉴别引物,人参以文献报道的特异鉴别引物为基础,分别采用两步法进行PCR扩增,从而对人参、西洋参及同属近缘种进行鉴别.结果:通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪进行考察,分别获得人参、西洋参快速PCR反应程序.在PCR产物中加入SYBR Green I染料,正品显示出明亮绿色荧光,而近缘种不显示荧光.结论:快速PCR方法可以简单快速鉴别人参、西洋参,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑.
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17个STR基因座快速多重扩增体系的建立及应用
目的 建立17个STR基因座多重PCR快速扩增体系.方法 采用人血样本提取DNA并定量,用于多重快速扩增体系分型准确性检测;采用标准品9948,设定稀释度,检测体系灵敏度;采用定量男女DNA样本按11种比例混合,检测体系对混合样本的分型能力;在标准品中加入干扰物质血红素和腐植酸,检测体系的抗干扰能力;对5种非人样本进行检测,评价体系的特异性;对实际案例进行检验,评价体系实际应用价值.结果 采用本文体系,在65min 内,用0.5 ～ 2ngDNA模板量能获得较好的扩增效果,分型结果准确稳定,扩增均衡;种属特异性好;血红素≤50 μmol/L,腐植酸≤25ng/μL时可不受干扰准确分型;男女混合样本中单一样本量不低于1/10即可进准确进行判断;对实际案例常见生物检材的检验结果良好.结论 本文17个STR基因座快速多重扩增体系可显著缩短扩增时间,技术性能符合实际检案要求,可在实践中选用.
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快速PCR扩增体系的建立及法医学应用
目的 建立快速PCR扩增体系,探讨其在法医实践中的应用价值.方法 设置不同的缓冲液、酶浓度与MgSO4浓度、热循环参数等,观察不同参数对扩增结果的影响,建立快速PCR扩增体系.使用该体系对常见检材进行STR分型,与常规方法扩增的结果比较,考察其分型准确性与扩增用时.结果 本文建立的快速PCR扩增体系含DNA TyperTM 19试剂盒的Primer Mix(5×)2μL; TaKaRa试剂的Fast BufferⅡ(10×)1μL,SpeedSTARTMHS DNAPolymerase(5 U/μL)0.3μL,MgSO4(50mmol/L)为0.1μ.扩增程序为95℃ 120s;95℃ 2s、61℃ 15s,27个循环;72℃60s.结论 快速PCR扩增体系分型结果准确,用时仅19min,缩短了常规扩增用时,有较大的法医学应用价值.
关键词： 法医物证学 DNA TyperTM19试剂盒 STR 快速PCR -
快速PCR扩增检验体系的建立及技术指标验证
目的 建立PCR快速扩增程序和体系,并对其技术指标进行验证.方法 运用快速扩增酶FastStart与DNA TyperTM15 plus primer mix组合并优化建立快速扩增体系,对50份静脉血卡和35份案例检材提取的DNA进行扩增,并对体系检测结果的准确性、稳定性和检材适应性进行验证;采用不同稀释浓度的标准品9947,采用快速扩增方法进行检测,验证体系的灵敏度.结果 模板DNA浓度达到0.50ng/μL,采用快速扩增体系可能获得准确分型;扩增耗时仅为69min,比常规扩增方法明显缩短;不同种类检材,经检测均获得良好分型图谱,同一份样本重复实验结果一致、稳定.结论 本文建立的快速扩增体系可显著提升检测速率,其灵敏度、准确性、稳定性、检材适用性等技术性能,可满足实际检验的需求.
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FTA卡血样快速直接PCR扩增方法比较初探
目的 探索FTA卡血样快速直接PCR扩增方法,比较相关方法的应用价值.方法 将DNA TyperTM 19试剂盒分别与3种快速试剂(Roche、TaKaRa、Fermentas)组合,以FTA卡血样为模板构建扩增体系,按照经优化的循环参数进行快速直接扩增,并与Typer19试剂盒常规方法相比较,对方法进行评价.结果 Typer19试剂盒分别与3种快速PCR检验试剂进行组合,均可实现快速直接扩增,STR分型结果均与常规方法一致,扩增用时60min,较常规扩增所需的215min缩短了约70％,但Typer19试剂盒与Roche试剂组合基因座间峰高有部分不平衡;与TaKaRa试剂组合扩增个别基因座出现双肩锋;与Fermentas试剂组合扩增峰高明显不平衡,且个别基因座存在双肩峰.结论 应用DNA TyperTM 19试剂盒与快速试剂组合直接PCR扩增方法,可有效缩短扩增时间,可根据效果在相关实践中选择使用.
关键词： 法医物证学 DNA TyperTM 19试剂盒 STR 快速PCR 直接PCR -
六色荧光标记快速PCR扩增体系的建立及验证
目的：建立PCR快速扩增程序和体系，并对其技术指标进行验证。方法采用六色荧光标记技术，对24个常染色体STR基因座、1个Y-STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座进行复合扩增及毛细管电泳检测，同时考察体系的灵敏度、特异性、同一性、稳定性、混合样本及批量样本测试，并观察各种常见检材及降解、脱落细胞检材的分型情况。结果所建立的体系灵敏度达0.0625 ng，快速扩增仅耗时65 min就可获得准确分型；种属特异性高；各种纸质血样本和混合、降解、脱落细胞检材的分型正确。结论本研究建立的快速扩增体系可显著提升检验速率，分型准确、稳定，对建立STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。
