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双相体系中固定化酶水解黄芩苷制备黄芩素的研究
该文研究了双相体系中固定卢-葡萄糖苷酶水解黄芩苷制备黄芩素的佳工艺条件并考察其产率,考察了黄芩素在多种有机溶剂中的溶解性及其在水与有机溶剂中的分配系数,确定了固定化酶催化黄芩苷酶解反应在醋酸缓冲液和氯仿组成双相体系中进行.以海藻酸钠为载体,用交联-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶,并测定了其适反应温度,适反应pH,米氏常数,热稳定性和pH稳定性等酶学性质.比较了固定化酶在双相体系中水解黄芩苷的产率,得出佳反应条件:pH 5.0的醋酸缓冲液和三氯甲烷组成的双相体系,反应温度50℃,反应时间10 h,黄芩素产率为85.28％.与单相反应体系相比,双相反应体系中反应速度和产率均有所提高.
关键词： 固定化β-葡萄糖苷酶 黄芩苷 黄芩素 双相体系 生物催化 -
定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展
定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复改造遗传多样性，结合文库高通量筛选而获得理想性状生物体的过程，现已成为在基础生物学和应用生物学领域应用广泛和有效的技术之一。目前已成功应用于蛋白质的研究和开发。蛋白质在生物催化、生物医药等领域具有广泛的应用。如何提高目的蛋白的产量、改善蛋白质的理化特性以及构建具有新催化活性的蛋白质以满足日益增长的需求是亟待解决的问题。而定向进化技术的发展为实现这样的目的提供了强有力的技术支持。本文就定向进化技术在蛋白质开发中的应用进行了综述。
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米格列醇关键中间体6-(N-羟乙基)-6-脱氧-氨基山梨糖的生物合成工艺优化
目的:优化米格列醇关键中间体6-(N-羟乙基)-6-脱氧-氨基山梨糖的生物合成工艺.方法:以N-羟乙基葡糖胺作为原料,采用单因素试验方法优化工艺.分别考察了温度、转化时间、静息细胞浓度、底物浓度及起始pH对氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞生物催化合成6-脱氧-6-羟乙基氨基山梨糖的影响.结果:在静息细胞浓度10％、底物浓度15％、起始pH 7.0,1 000 mL摇瓶装液150 mL,30℃,200 r·min -1条件下振荡转化10h,底物转化率可达93％.结论:该生物转化工艺切实可行.
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他汀类药物中间体的生物催化合成研究进展
他汀类药物是一类重要的降血脂药物,(3R,5S)-二羟基酯是他汀类药物发挥作用的关键结构,也是合成该类药物过程中的重要中间体,因其结构中具有两个手性碳原子,故含有(3R,5s)-二羟基酯结构中间体的制备在某种程度上已成为他汀类药物制备的限速步骤.该文对他汀类药物的类型、作用机制、化学结构和合成路线进行概述.着重对近几年采用生物催化方式制备具有(3R,5S)-二羟基酯结构中间体的方法进行简述.
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生物催化在手性药物制备中的应用
随着生物催化技术的不断发展,应用于手性药物制备过程中的生物催化也越来越广泛.该文仅就近5年来生物催化在手性药物制备中的应用情况进行综述.
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手性药物合成中酶的高通量筛选进展
目的 介绍手性药物合成中酶的高通量筛选方法的进展.方法 根据近年发表的关于手性药物合成中酶的高通量筛选文献共30篇,对其进行综述.结果 介绍了一系列的立体选择性酶筛选方法.包括化学发光和荧光法,pH指示剂法,酶偶联分析法等,这些方法都体现了高通量的原则,即快速、高效、可靠.结论 高通量筛选方法对于寻找新的酶和生物催化剂意义重大.
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重组P450BM3:生物催化的多面手
目的 介绍近年来重组P450BM3在生物催化领域的研究进展,为定向进化P450BM3获得催化其它底物的突变体提供参考.方法 通过系统的文献调研,以近年来60余篇外文相关文献为依据进行归纳总结.结果 介绍了P450BM3结构与功能关系,并对已报道的P450BM3及其突变体催化的反应进行分类与总结.结论 为拓展P450BM3催化的底物谱奠定基础.
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尼克酰胺酶法再生系统及其主要耦联酶系在药物合成中的应用
目的 探究尼克酰胺酶法再生系统及其主要耦联酶系在药物合成中的应用.方法 查阅近10年涉及尼克酰胺酶法再生系统参与生物催化法合成药物的相关文献,研究尼克酰胺酶法再生系统的酶系及相关耦联酶系在药物合成中的应用,以及优化再生系统的有效方法.结果 尼克酰胺辅酶再生系统是利用生物催化实现药物合成的重要环节,要综合考虑反应参与的酶系、反应体系的诸多因素,使辅酶高效再生.结论 酶法再生系统将有利于昂贵的尼克酰胺辅酶有效再生,使生物催化反应顺利进行,为手性化合物的合成提供新思路和新方法.
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头孢菌素C乙酰化酶高通量筛选方法的改进
目的 改进头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)乙酰化酶高通量筛选方法,获得催化活性显著提高的突变体.方法 基于对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,p-DAB)与7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)的复合物在405 nm有大吸收值的原理,采用无菌96孔深孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达,再以含溶菌酶和DNase的缓冲液进行菌体裂解,后以96孔板进行底物的水解和反应终止,经p-DAB显色后,利用酶标仪进行产物的快速定量,以实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选.结果 利用改进的p-DAB比色法从先前建立的突变文库中筛选到2个在13℃下比酶活明显提高的突变子1A10和2G8,其比酶活分别为1.7和2.4 U/mg,较原酶的0.85U/mg显著提高.在优化的筛选条件下,A405的变化能够准确反映酶活性的大小,确保了该方法筛选结果的可信度.结论 改进的p-DAB比色法具有筛选快速,操作简便,筛选通量大及准确度高等优点,能够提高CPC乙酰化酶改造及筛选的效率,为低温CPC乙酰化酶的创制提供了技术支持.
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他汀类药物中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯生物催化合成的研究进展
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂即他汀类药物的关键手性中间体.本文综述生物催化合成(S)-CHBE的研究进展.
关键词： (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 他汀类药物 生物催化 -
酵母催化2-辛酮不对称还原反应特性与醇脱氢酶基因表达水平的关联性研究
研究通过介质工程,选择4种LogP值(分配系数的对数值)的有机溶剂,采用气相色谱技术检测有机溶剂对酿酒酵母催化2-辛酮不对称还原反应的催化活性与反应选择性的影响,并通过荧光定量PCR(RT-PCR)检测不同水/有机溶剂两相体系下YADH1与YADH2基因表达情况,旨在探究不同水/有机溶剂两相体系与酿酒酵母催化2-辛酮不对称还原反应特性的关系,并考察其反应特性与YADH基因的表达水平之间是否存在关联,试图从基因表达水平解释不同有机介质中酵母催化羰基不对称还原特性的内在机制,从而为获得重要手性中间体(S)-2-辛醇产物提供理论指导.分析结果表明,不同水/有机溶剂两相体系对酿酒酵母催化2-辛酮羰基不对称还原反应的催化活性与反应选择性有较大影响,其中,催化活性在水/有机溶剂两相体系比单水相体系降低,但反应选择性却有较大提高(甲苯除外),而且logP值(分配系数的对数值)越大,产物对映体过量(Enantiomeric excess,e.e)值也越大.进一步研究表明,YADH基因表达水平与酵母羰基不对称还原反应特性有重要关联,YADH基因表达水平与酵母催化活性呈正相关,但与反应选择性呈负相关.
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酶在有机溶剂中的生物催化性能及其固定化技术
在有机相中,酶具有与其在水相中相同的晶体结构,能够正确折叠和恢复活性,其活性严重依赖于干燥前水相的pH值,并受有机溶剂中水含量的影响.有机介质中水分子的存在对于保持天然蛋白质的活性构象和控制蛋白质表面基团的离子化状态具有重要作用.盐种类及有机介质对有机相中酶催化反应的对映体选择性有重要的影响.酶经固定化后,底物在酶分子间的传质阻力减少,酶活得以增大.固定化酶介质对固定化酶活具有较大的有影响.文章还介绍了有机相中固定化酶的新方法.
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生物催化法研究何首乌二苯乙烯苷生物合成途径中的聚酮反应
目的:利用生物催化法研究中药何首乌活性成分二苯乙烯苷生物合成途径中的聚酮反应.方法:以丙二酰辅酶A和4-香豆酰辅酶A为底物,利用何首乌愈伤组织粗酶进行体外酶催化,采用高效液相色谱和液质联用方法检测催化产物,硫酸铵盐析法和SDS-PAGE对不同组分的粗酶进行分析.结果:生物催化产物和白藜芦醇对照品的色谱峰保留时间均为23 min;在负离子模式下,催化产物质谱图的质荷比为227,与白藜芦醇对照品相吻合;硫酸铵盐析结果显示盐析梯度为40％～70％沉淀的粗酶具有催化活性,并且梯度为50％～60％沉淀的粗酶活性高,不同硫酸铵盐析梯度沉淀的蛋白SDS-PAGE图谱条带差异较大,梯度为50％ ～ 60％沉淀的蛋白中发现分子量约42 kDa的条带,与芪合酶分子量一致.结论:何首乌二苯乙烯苷生物合成途径中聚酮反应的产物为白藜芦醇,并非二苯乙烯苷,从而推测二苯乙烯苷可能是由白藜芦醇转化而来,并非聚酮反应的直接产物.
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微生物转化技术在现代医药工业中的应用
对微生物转化技术在现代医药工业应用上的独特优势,特别是在手性药物或药物中间体制备、借助微生物转化手段实施组合生物催化在新药筛选方面发挥的积极作用进行了阐述分析,并结合作者自身近年来在该技术领域的实践和收获对数个相关课题作了介绍.
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变形假单胞菌整细胞催化二氢色酮及其类似物的不对称还原反应
目的 使用具有甲苯降解能力的假单胞菌株作为生物催化剂,通过不对称还原反应实现手性醇的对应选择性合成.方法 采用悬浮细胞生物转化法用于二氢色酮及其类似物的不对称还原反应研究,产物通过手性液相色谱进行分析.结果 筛选获得Pseudomonas plecoglossicida ZMU-T06作为具有较高活性和对映选择性的生物催化剂,可获得对映选择性为65％ ～ 96％和87％ ～97％产率的相应手性醇产物,得到高可达94％的产率和具有92％的对映选择性的手性醇产物.结论 通过生物催化实现了二氢色酮及其衍生物C=O键的不对称还原反应,合成了相应的手性醇类化合物.
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单加氧酶基因筛选表达及其在苯甲亚砜中的合成应用
目的 克隆和表达假单胞菌菌株Pseudomonas monteilii CCTCC M2013683的单加氧酶基因并研究其在手性亚砜合成中的应用.方法 根据假单胞菌菌株Pseudomonas monteilii CCTCC M2013683基因组序列,选取3个单加氧酶基因设计特异性的PCR引物,利用PCR技术,以菌株基因组DNA为模板扩增基因片段,构建重组质粒pET-32a-pmmo,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白.以构建的重组菌为生物催化剂,苯甲硫醚为底物进行催化反应.结果 扩增获得了3个目的基因并构建了相应的重组质粒,诱导表达的3个重组蛋白中有2个(pmmo-3546、pmmo-6814)具有活性,可催化苯甲硫醚转化为R构型的苯甲亚砜.结论 成功获得了具有R-选择性催化苯甲硫醚活性的单加氧酶重组蛋白.
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对映选择性羟化乙基苯的碳氢键合成(R)-和(S)-1-苯基乙醇
目的 筛选出具有能对乙基苯的苄位C-H键发生对映选择性羟基化反应,并具有较好R和S选择性的菌株.方法 采用悬浮细胞生物转化法对乙苯的对映选择性羟基化进行研究,产物采用液相色谱法进行分析.结果 通过整细胞催化分别获得具有90％的转化率,86％ ee的(R)-1-苯基乙醇和具有91％的转化率,98％ ee的(S)-1-苯基乙醇.结论 菌株ZMU-T03和ZMU-T11分别对乙基苯苄位C-H键显示出了较好的?和(S)-选择性.
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生物催化还原亚胺类化合物制备手性胺的研究进展
近些年,亚胺的不对称催化还原制备手性胺逐渐成为有机合成中的一个研究热点,其方法主要包括金属催化、有机小分子催化和生物催化的不对称还原.本文着重介绍生物催化还原方法中亚胺还原酶的筛选、相关基因的克隆表达以及用于亚胺还原的人工金属酶的研究进展.
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灰色葡萄孢霉产漆酶性质的研究及其对白藜芦醇的催化
目的 研究灰色葡萄孢霉在生长过程中合成的一种漆酶的部分酶学性质,该漆酶能催化白藜芦醇聚合生成其脱氯二聚体viniferin,此二聚体具有比白藜芦醇更高的生物学活性.方法 通过培养灰色葡萄孢霉获得该漆酶的粗酶液,测定其适pH及温度,并用其对白藜芦醇进行催化.结果 该漆酶的适pH为4.9,适反应温度为26℃,对20 mg·L-1的白藜芦醇有较好的催化效果.结论 灰色葡萄孢霉在生长过程中合成的漆酶可以催化白藜芦醇而生成viniferin.
