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补肾调经方对小鼠体外培养卵泡卵母细胞BMPR Ⅱ/ALK6-Smads表达的影响
目的 观察补肾调经方对小鼠体外培养窦前卵泡成活数及卵母细胞骨形成蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein receptor Ⅱ,BMPR Ⅱ)/激活素受体样激酶6-Smads(activin receptor-like kinase 6-drosophila mothers against decapentaplegic proteins,ALK6-Smads)信号通路的影响,探讨其提高体外生长卵泡卵母细胞质量的作用机制.方法 65只12日龄健康雌性昆明小鼠,采用机械法分离其窦前卵泡,分别以正常大鼠血清、高、中、低剂量补肾调经方大鼠含药血清、高剂量补肾调经方大鼠含药血清+ K02288孵育,分为对照组、补肾高、中、低剂量组(即补肾组)、抑制剂组,普通法体外培养.培养第6天比较补肾组与对照组窦前卵泡成活数,实时荧光定量PCR法检测卵母细胞中BMPR Ⅱ、ALK6、Smad1、Smad5、Sm ad8 mRNA表达;细胞免疫荧光法检测上述指标和磷酸化的Smad1/5/8(phospho-Sm ad1/5/8,p-Sm ad1/5/8)蛋白表达水平.结果 与对照组比较,补肾高剂量组窦前卵泡成活数增加,补肾各剂量组BMPR Ⅱ、ALK6、Smad5、Smad8 mRNA表达水平升高,上述指标及p-Smad1/5/8蛋白表达水平升高,补肾高、中剂量组Smad1 mRNA及其蛋白表达水平升高(P＜0.05).与补肾高剂量组比较,抑制剂组p-Smad1/5/8蛋白表达降低(P＜0.05).结论 补肾调经方能增加体外培养窦前卵泡成活数,提高卵母细胞质量,其作用机制可能与调控卵母细胞中BMPR Ⅱ/ALK6Smads信号通路有关.
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窦前卵泡的分离与体外培养
哺乳动物卵巢中含有大量的窦前卵泡,如何开发和利用这一资源,获取大量成熟并具有受精能力的卵母细胞,已成为现今的研究热点.研究窦前卵泡的分离与体外培养不仅可以为女性提供生殖保险,还可以在细胞和分子水平研究卵母细胞的生长发育及凋亡机制,为建立人类卵子库提供实验依据.对相关研究结果进行综述.
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体外受精胚胎移植周期提前抽吸优势卵泡与获卵质量关系初探
通过控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)获得一定数量较高质量的卵子是影响体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and Embryo transfer,IVF-ET)结局的关键点之一.常规IVF周期中应用大剂量外源性促性腺激素,使得高血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)水平满足了阈值较高的窦前卵泡的生长要求,导致大量窦前卵泡募集,从而达到许多卵泡同时发育的目的.
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豚鼠卵巢组织片和分离的窦前卵泡玻璃化冷冻效果比较
目的:比较分析不同玻璃化冷冻配方对豚鼠卵巢组织片和单个窦前卵泡形态、存活率及体外发育能力的影响.方法:取5周龄雌性豚鼠卵巢,实验分新鲜对照组、组织片A液毒性组、组织片B液毒性组、卵泡A液毒性组和卵泡B液毒性组,及相应的冻融组,即组织片A液冻融组、组织片B液冻融组、卵泡A液冻融组、卵泡B液冻融组,共9组行毒性试验和冷冻保存.各组卵巢组织片行HE染色形态学观察,分离窦前卵泡经锥虫蓝染色活力测试并行体外培养.结果:A液冻融组和B液冻融组豚鼠卵巢组织片HE染色光镜观察可见大部分卵泡形态正常,A液组和B液组异常窦前卵泡数与新鲜对照组比较差异有统计学意义(P＜ 0.05);在分离的窦前卵泡锥虫蓝染色活力测试中,冻融卵巢组织片A组的卵泡复苏率(为66.1％)显著低于(P＜ 0.05)冻融卵泡B液组(为78.5％)和新鲜对照组(为87.5％);其余组别之间差异无统计学意义.体外培养卵泡发育情况组织片冷冻组比卵泡冷冻组差,以A液组尤甚,第6天存活卵泡数目不足(为20.0％),与新鲜对照组(为60.0％)及卵泡B液冻融组(为50.0％)相比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:玻璃化冷冻法能较好地冷冻保存豚鼠卵巢组织片和分离的窦前卵泡,而单个豚鼠窦前卵泡玻璃化冷冻优于卵巢组织片的玻璃化冷冻;B液较A液更适合豚鼠卵巢卵泡的玻璃化冷冻保存.窦前卵泡的体外培养证明玻璃化冷冻复苏卵泡具有一定的继续发育能力.
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两种冷冻方法对牛卵巢组织窦前卵泡活性的影响
目的：探讨两种冷冻方法对牛卵巢组织窦前卵泡活性的影响。方法：取新鲜的牛卵巢组织随机分为新鲜对照组、程序化冷冻组和玻璃化冷冻组，分别加入Liberase DH酶消化，然后挑取窦前卵泡并分类计数，用calcein AM以及ethidium homodimer对窦前卵泡进行荧光染色，鉴定窦前卵泡的活性。结果：3组各级卵泡的数量及分布差异无统计学意义（ P＝0．765）；与新鲜对照组（91％）相比，程序化冷冻组和玻璃化冷冻组窦前卵泡中未受损卵泡所占比例（80％和78％）略有降低（ P＝0．012）。3组中所占比例占优势的始基卵泡中未受损卵泡率差异无统计学意义（P＝0．079）；与新鲜对照组相比，两冷冻组初级卵泡中未受损卵泡率有所降低（P＜0．05），但两冷冻组间差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论：程序化冷冻法和玻璃化冷冻法均能较好地保存卵巢组织窦前卵泡的活性。
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小鼠窦前卵泡体外培养的研究
目的探讨不同直径的窦前卵泡的培养对获得成熟卵母细胞的影响.方法出生10天的小鼠窦前卵泡体外培养12天.直径小于80μm的卵泡258个为A组;直径80～110μm的卵泡306个为B组.观察卵泡形态的变化,测量卵泡直径的变化.结果A组卵泡成活率56.2%,窦腔形成率13.1%,卵母细胞成熟率11.7%;B组卵泡成活率89.5%,窦腔形成率51.8%,卵母细胞成熟率56.6%.B组卵泡成活率、窦腔形成率和卵母细胞成熟率显著高于A组(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01).A组卵泡直径(72.5±15.7)μm,培养后卵泡直径(246.3 ±22.2)μm(P＜0.01);B组卵泡直径(101.7±20.1)μm,培养后卵泡直径(370.3±33.9)μm(P＜0.05).A组卵母细胞直径(52.3±4.4)μm,培养后卵母细胞直径(68.5±9.3)μm(P＜0.01);B组卵母细胞直径(55.6±5.8)μm,培养后卵母细胞直径(71.9±5.7)μm(P＜0.01).结论出生10天小鼠窦前卵泡培养后可以得到第二次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞;直径80μm以上的卵泡成活率,窦腔形成率,卵母细胞成熟率较高,培养效果较好.
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苍附导痰汤对米非司酮诱导PCOS大鼠卵巢形态及雄激素的影响
目的 探讨苍附导痰汤对米非司酮诱导多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)大鼠卵巢形态及雄激素的影响.方法 60只Wistar大鼠分为正常组、模型组、二甲双胍组和苍附导痰汤高、中、低剂量组.采用皮下注射米非司酮造模并以阴道涂片监测大鼠发情周期,造模成功后各组灌胃干预9 d,处死动物,称量双侧卵巢质量,HE染色观察卵巢形态及卵泡发育情况,放射免疫法测定血清睾酮水平.结果 和正常组比较,模型组大鼠血清睾酮水平、卵巢指数、窦前卵泡及初级卵泡数量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);和模型组比较,中药组及二甲双胍组大鼠血清睾酮、窦前卵泡数量、初级卵泡数量都明显降低(P<0.05).结论 苍附导痰汤作用于米非司酮诱导的PCOS大鼠,可降低血清睾酮水平,使PCOS大鼠窦前卵泡、初级卵泡数量明显减少,改善卵巢多囊样改变.
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顺铂致体外培养大鼠窦前卵泡损伤模型的建立
目的 探索建立顺铂(cisplatin,CDDP)大鼠窦前卵泡损伤的模型.方法 以SD大鼠窦前卵泡为研究对象,将5组不同剂量(0、0.25、0.5、1、2 μg/mL)的CDDP加入到体外培养的大鼠窦前卵泡培养液中.作用24 h后,用光镜和Hoechst33342/PI荧光双染观察窦前卵泡的形态学变化,用化学发光法检测窦前卵泡培养液中的雌二醇(E2)水平.结果 CDDP浓度≥1 μg/mL时,窦前卵泡的形态发生明显改变,培养液中E2浓度降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 1 μg/mL的CDDP作用24 h后即可明显抑制大鼠窦前卵泡的生长,出现闭锁现象.该模型的窦前卵泡形态及E2水平出现明显变化,与人类CDDP导致的卵巢功能早衰的病变过程相似.
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骨髓间充质干细胞对顺铂所致的大鼠窦前卵泡损伤的保护作用
目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对顺铂(DDP)所致的体外培养大鼠窦前卵泡损伤的保护作用.方法:实验分为3组,每组为30个窦前卵泡.实验组:取第3代MSCs,贴壁生长后,将大鼠窦前卵泡移入培养板内共培养24小时后换液,加入1 μg/ml DDP,作用24小时后换新鲜基础培养液;实验对照组:未行MSCs共培养,直接将大鼠窦前卵泡移入培养液中培养,后面方法同实验组;空白对照组:大鼠窦前卵泡移入培养液中培养,不加入DDP.光镜下观察3组窦前卵泡的形态学变化,采用化学发光法分别检测加药后第3、5、7天各组培养液中雌二醇(E2)的浓度.结果:①实验组窦前卵泡第3、5天均存活,第7天仅少数窦前卵泡变黑,但卵母细胞清晰可见;实验对照组窦前卵泡第3天出现退化现象,第7天则完全退化;空白对照组窦前卵泡第3天形态尚规整,但第7天大多数卵泡出现退化现象.②实验组中E2含量随着时间的变化逐渐升高(P＜0.05);空白对照组E2含量随着时间的变化逐渐下降(P＜0.05);实验对照组E2含量低,变化不大,3个时间点比较,差异无统计学意义(P＞0.05).3组间大鼠窦前卵泡培养液中E2含量间有主效应(P＜0.05),时间和组别之间存在交互效应(P＜0.05).结论:MSCs对DDP引起的窦前卵泡的损伤可能有保护作用,可恢复并促进窦前卵泡的内分泌功能.
