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六味地黄丸、金匮肾气丸及健骨二仙丸含药血清对BMSCs成脂、成骨细胞分化相关基因的影响
目的 研究补肾方药对大鼠骨髓间充质干细胞(B MSCs)来源的前脂肪细胞向成骨分化的影响.方法 采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,用经典化学方法诱导BMSCs为前脂肪细胞,用六味地黄丸、金匮肾气丸和健骨二仙丸含药血清(含量浓度均为10％,分别代表补肾阴、补肾阳和补肾填精方药),干预前脂肪细胞成骨分化过程；采用反转录-实时荧光定量PCR技术(RT-real time qPCR),分别于第6、12和18天,检测成骨分化相关基因RUNX2、ALP、BGP、BMP2、BMP4、SPP1和IGF1 mRNA,及成脂分化相关基因LPL、FABP4和PPARγ mRNA表达水平.结果 对于成骨分化相关基因,与对照组比较,第6天各组基因表达无显著变化(2.0 ＞Ratio ＞0.5)；第1 2天,金匮肾气丸组IGF1和RUNX2mRNA表达升高较为显著,相对表达量(Ratio)分别为2.97和1.81；第1 8天,各组IGF1 m RNA表达均显著上升,六味地黄丸组、金匮肾气丸组和健骨二仙丸组Ratio值分别为3.74、12.60和8.35；各组SPP1 mRNA表达也显著升高,Ratio值分别为2.94、3.18和2.62.对于成脂分化相关基因,第6天,六味地黄丸组和金匮肾气丸组FABP4 mRNA表达显著下降(Ratio分别为0.47和0.40),其他基因表达均下调,但不显著；第12天和第18天,成脂分化基因表达变化均无显著变化(2.0 ＞Ratio ＞0.5).结论 成骨分化相关基因在补肾方药作用较晚时间出现表达上调的变化,而成脂分化相关基因在补肾方药作用较早时间即出现表达下调的改变,并且提示补肾阳法促进成骨分化、抑制成脂分化作用更为显著.
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健骨二仙丸含药血清对人成骨细胞增殖及细胞周期的影响
目的:在临床研究和动物实验的基础上,进一步探讨健骨二仙丸对成骨细胞增殖和细胞周期的影响.方法:分离、培养人的原代成骨细胞,采用3H-胸腺嘧啶掺入法和四氮唑蓝法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期.结果:健骨二仙丸中、高剂量组细胞增殖率、S期细胞比率和细胞增殖指数等均显著高于空白对照组(P＜0.01,P＜0.05),与雌激素组比较差异无显著性.细胞凋亡率和G0-G1期细胞比率显著低于空白对照组(P＜0.01,P＜0.05).结论:健骨二仙丸能有效促进成骨细胞的增殖、分化,防止成骨细胞的凋亡.
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健骨二仙丸对人工关节周围界膜TNF-α表达的影响
目的 探讨中药健骨二仙丸对体外培养假体周围界膜TNF-α表达的抑制作用,为健骨二仙丸防治假体周围骨溶解提供科学依据.方法 将备用的人工关节周围界膜组织培养液加入实验用大鼠含中药健骨二仙丸生药含药血清中,分空白对照组、健骨二仙丸组、固邦组,各组又分别分10%、20%两个浓度亚组,共计6个组,每组8个培养孔,各组添加空白血清或含药血清后在5%CO2、37℃饱和湿度下培养72 h,取上清液,用ELISA法测定TNF-α的含量,上述界膜组织标本同时做细菌培养.结果 48个培养孔中的组织培养均成功,全部进入结果分析.①TNF-α水平:10%与20%空白对照组比较差异无显著意义(P>0.05).10%健骨二仙丸组与空白对照各组相比差异无显著意义(P>0.05);20%健骨二仙丸组低于空白对照各组(P<0.05).10%与20%固邦组低于空白对照各组 (P<0.05和P<0.01).20%健骨二仙丸组与10%和20%固邦组比较,差异无显著意义(P>0.05).②人工关节周围界膜组织细菌培养结果为阴性.结论 健骨二仙丸能够抑制磨损颗粒诱导的假体周围界膜细胞因子的分泌,进而阻止假体周围破骨细胞性骨溶解,对假体无菌性松动可能具有较好的防治作用.
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人工关节周围界膜白细胞介素6的表达及健骨二仙丸的干预效应
目的:观察中药健骨二仙丸对体外培养人工关节假体周围界膜白细胞介素6表达的抑制作用,为健骨二仙丸防治人工关节假体周围骨溶解提供科学依据.方法:实验于2006-09/12在深圳市中医院中心实验室(国家级P2实验室)完成.①体外界膜组织培养:将备用的人工关节假体周围界膜(20 g,取自右股骨颈骨折人工关节置换术后11年出现假体无菌性松动来深圳市中医院行翻修术患者,女性,74岁,对实验知情同意并经医院伦理委员会批准)放入Hank's液中清洗后置于RPMI培养液中,然后将界膜标本用眼科剪剪成1 mm3大小组织悬浮液.②含药血清制备:按每日中药健骨二仙丸生药12.0 g/kg大鼠体质量灌胃(相当于临床剂量的6.25倍),每日固邦用量为1.04 mg/kg体质量(相当于临床剂量的6-25倍).2次/d,间隔5 h,连续灌胃3 d.末次灌药1 h后,从腹主动脉取血,离心获取血清.③分组:取24孔培养板2块,分空白对照组、健骨二仙丸组、固邦组,各组又分别分100 g/L,200 g/L两个质量浓度亚组,共计6个组,每组8个培养孔.100 g/L质量浓度组相应加入0.9 mL组织悬液和0.1 mL空白血清或健骨二仙丸、固邦含药血清.200 g/L质量浓度组相应加入0.8 mL组织悬液和0.2 mL空白血清或健骨二仙丸、固邦含药血清.④实验评估:各组添加空白血清或含药血清后在体积分数为0.05 CO2、37℃饱和湿度下培养72 h,取上清液,用酶联免疫吸附法测定白细胞介素6的含量.上述界膜组织标本同时做细菌培养.结果:48个培养孔中的组织培养均成功,全部进入结果分析.①白细胞介素6水平:100 g/L与200 g/L空白对照组比较差异无显著意义[(97.113±11.989),(96.275±13.087)ng/L,p＞0.05].100 g/L健骨二仙丸组[(92.288±10.397)ng/L]与空白对照组相比差异无显著性(P＞0.05);200 g/L健骨二仙丸组[(82.263±9.580)ng/L]低于空白对照各组(P＜0.05).100 g/L与200 g/L固邦组[(83.300±9.039),(79.338±11.118)ng/L]低于空白对照各组(p＜0.05和P＜0.01).200 g/L健骨二仙丸组与100 g/L和200 g/L固邦组比较,差异无显著性.②人工关节周围界膜组织细菌培养结果为阴性.结论:健骨二仙丸能够抑制磨损颗粒诱导的人工关节假体周围界膜细胞因子的分泌,进而阻止假体周围破骨细胞性骨溶解,对人工关节假体无菌性松动可能具有较好的防治作用.
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健骨二仙丸介导间充质干细胞的成骨细胞定向诱导及其成骨活性
目的:研究健骨二仙丸对间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成骨细胞定向分化及其成骨活牲的影响.方法:采用标准Ficoll-Hypaque技术分离人脐血MSCs,以地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C为辅剂定向诱导成骨细胞,碱性磷酸酶、骨矿化结节、骨钙素及上清钙含量与Ⅰ型胶原作为成骨细胞鉴定与活性评价的指标.另以健骨二仙丸或健骨二仙丸合地寒米松、β-磷酸甘油与维生素C为辅剂诱导,用正常培养液作为空白对照,15 d后观测对比上述相关指标.结果:健骨二仙丸不能单独诱导MSCs向成骨细胞转化,对MSCs成骨细胞诱导前后的细胞形态无任何影响.定向成骨细胞诱导后,健骨二仙丸能显著提高其标志性产物碱性磷酸酶、骨矿化结节和上清钙、骨钙素以及Ⅰ型胶原的表达.结论:健骨二仙丸作为补肾益气药能促进MSCs成骨细胞定向转化,提高其成骨活性.
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健骨二仙丸对成骨细胞分化及IGF-ImRNA表达的影响
目的:在临床研究和动物实验的基础上,进一步探讨健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响及其作用机制.方法:分离、培养人的原代成骨细胞,采用PNPP法、RIA法、茜素红染色法以及定量RT-PCR法分别检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、矿化结节形成和I型前胶原mRNA的表达,从而了解健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响.定量RT-PCR和Northern印迹杂交等方法交观察成骨细胞胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor-I)IGF-I mRNA的表达.结果:健骨二仙丸中、高剂量能显著增加碱性磷酸酶的活性,及矿化结节形成的数量,促进成骨细胞骨钙素的释放(P＜0.01,P＜0.05),与雌激素(倍美力)组比较差异无显著性.显著增加成骨细胞Ⅰ型前胶原mRNA和IGF-I mRNA的表达.结论:健骨二仙丸促进成骨细胞IGF-I mR-NA的表达,从而进一步促进成骨细胞的增殖、分化,改善成骨细胞功能,调节骨重建偶联.表明健骨二仙丸不仅能增加成骨细胞胶原蛋白地合成,而且能促进非胶原蛋白地表达.促进骨的形成是健骨二仙丸作用的主要机制.
关键词： 成骨细胞 分化 I型前胶原 胰岛素样生长因子-I 健骨二仙丸 -
六味地黄丸、金匮肾气丸和健骨二仙丸对大鼠BMSCs向脂肪细胞分化相关基因表达的影响
目的:研究补肾益气功效的六味地黄丸、金匮肾气丸和健骨二仙丸对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化的影响.方法:采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,补肾阴、补肾阳和补肾健骨方药(代表方分别为六味地黄丸、金匮肾气丸和健骨二仙丸)含药血清干预BMSCs成脂分化过程,采用反转录-实时荧光定量技术(RT-q real-time PCR),观察成脂分化相关基因Lpl、Fabp4和PparγmRNA表达水平的变化.结果:与10％正常大鼠血清相比较,Fabp4 mRNA在补肾阴组、补肾阳组(10％含药血清)表达水平均下降33％,但无统计学意义;LplmRNA在补肾阳组和补肾健骨组(10％含药血清)表达水平下降,其中补肾阳组具有统计学意义.PparγmRNA在其它各组表达无显著性变化.结论:六味地黄丸、金匮肾气丸和健骨二仙丸对转录因子表达水平无显著改变,但对其下游靶基因表达水平有显著下调作用,金匮肾气丸对成脂分化过程中成脂相关基因下调作用为明显,推测其抑制骨髓间充质干细胞成脂分化能力较其它功效的方药更强.
