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表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定
对CAV-2的E3区的Ssp Ⅰ片段进行缺失构建了E3区缺失载体pVAX△E3,然后将CPV VP2表达盒连接到pVAX△E3的E3区缺失处,构建了CPV VP2表达盒的转移载体p△ECPV-VP2,用Sal Ⅰ+Nru Ⅰ分别对pPoly2-CAV2和p△ECPV-VP2进行双酶切,分别进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,将含CPV VP2表达盒的Sal Ⅰ+NruⅠ片段定向克隆入pPoly2-CAV-2载体,获得了含CPV VP2表达盒重组CAV-2基因组的质粒pCAV-2/CPV-VP2.用Asc Ⅰ+Cla Ⅰ对pCAV-2/CPV-VP2进行双酶切,释放CAV-2/CPV-VP2重组基因组,将CAV-2/CPV-VP2基因组与去除Sal Ⅰ+Nru Ⅰ片段的CAV-2基因组的两个片段混合,利用脂质体介导共转染DK细胞,出现病变,获得重组病毒CAV-2/CPV.并且,从形态学、基因组水平、目的基因的转录及重组病毒的生长特征等方面进行了鉴定.结果证明,CAV-2/CPV具有典型的CAV-2形态特征,CAV-2/CPV在繁殖的过程中没有对CPV VP2表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录CPV VP2的mRNA.CAV-2/CPV的繁殖速度比野生型CAV-2的繁殖速度慢.
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冀、京、吉犬群犬腺病毒中和抗体调查
目的 为表达狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒(CAV-2)重组狂犬病口服疫苗的投放工作提供流行病学依据.方法 通过病毒中和试验对随机采自河北省,北京市,吉林省等地的387份犬血清进行犬腺病毒中和抗体检测,以确定犬群腺病毒感染率.结果 河北、吉林农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,阳性率为16%(30/192),而北京市犬腺病毒中和抗体阳性率高达69%(135/195),说明城乡犬只犬腺病毒中和抗体存在明显差异.结论 农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,适用于CAV-2及其重组疫苗首次免疫、尤其是口服免疫.
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犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达
核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108-1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAXAE3LPN.以含CAV-2 SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变.电镜负染、切片观察,酶切、PCR.扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa.
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不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析
根据已发表的CAV纤突基因序列,用PCR方法,对4个CAV-2毒株和4个CAV-1毒株的纤突基因进行了扩增和测序,测定的核苷酸序列经推导得到分别编码543和542个氨基酸的CAV纤突蛋白全序列.测定的CAV2比较表明:我国流行的CAV-2 SY强毒株与国外标准强毒株Toronto A26/61株柏同,其驯化致弱的毒株与驯化前相比在1134位发生碱基颠换.测定的CAV-1比较表明:我国流行的CAV-1株与标准强毒RI261株差异相对较大,而国内CAV-1毒株互相之间相对差别较小.CAV-2与CAV-1纤突基因的同源性为80.48%.
