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黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株的分离鉴定及全基因组序列分析
收集吉林蜂场的蜜蜂蜂蛹病料的RNA作为扩增模板,依据GenBank公布的黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)的全基因组序列,自行设计了10对引物,运用RT-PCR首次获得中国BQCV毒株的全基因组序列,命名为中国BQCV-JL1株.其全基因组序列由8 358个碱基组成,与GenBank公布的其他6株BQCV毒株的全基因组序列相比,同源性为86％～93％.中国BQCV-JL1株ORF 1的位置为546 nt～4 676 nt(4 131 nt),ORF 2位于5 750 nt～8 203 nt,两个ORFs之间存在一段长为543 nt(4 891 nt～5 433 nt)的ORF3.中国BQCV-JL1株第一个基因功能区ORF1'的位置为546 nt～5 429 nt,包含ORF 1和ORF 3.在ORF2之前存在内部核糖体进入位点(IRES),其末尾3碱基为CCU(5 642 nt～5 644 nt),为促进ORF 2翻译的起始密码子,中国BQCV-JL1株第二个基因功能区ORF2'的位置为5 642 nt～8 203 nt.中国BQCV-JL1株与Hungary 10(EF517515)同源性高(93％),且分析核苷酸序列和氨基酸序列,与South Korea(JX149531)株接近,表明中国BQCV-JL1株与South Korea(JX149531)株均有可能来自欧洲.中国BQCV-JL1株与其他6株全基因组序列在ORF位置划分上存在差异,其原因是部分位置发生基因突变.
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诺如病毒CHN02/LZ35666株RdRp和VP1基因序列分析
诺如病毒(Noroviruses, NVs)为杯状病毒科的一个属,是引起人类病毒性胃肠炎暴发的重要病原.在美国、欧洲和日本,病毒性胃肠炎暴发中由NV引起的占93%[1-3].NV的基因组为单股正链RNA,全长约7.7kb,由3个开放阅读框(open reading frames, ORFs)组成,ORF1编码非结构蛋白,其中包括RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp )[4],ORF2和ORF3分别编码主要(VP1)和次要(VP2)衣壳蛋白[5].VP1蛋白折叠成两个区域,壳区(Shell,S)和突出区(Protruding,P),S区形成内壳,P区形成拱样结构突出于内壳外.P区进一步分为P1和P2亚区,后者位于衣壳的外面, P2区相对于S区和P1区序列高度变异,被认为是免疫识别和受体结合的关键部位[6-9].
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RNA干扰
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是几近年发现的基因表达调节新机制,双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)以调节子的身份降解目的mRNA,从而调节目的基因的表达.这一发现使人们重新认识了RNA在基因信息流控制过程中的重要性.RNAi的发生机制除了研究多的转录后基因沉默外,还发现与翻译水平调节和基因组甲基化等事件有关.RNAi被应用于生命科学的很多方面:在基因功能研究中它已成为倍受青睐的基因敲下的工具,而且它正促使新一轮基因组范围内基因功能研究运动的蓬勃开展;在癌症、病毒疾病以及代谢失调症等重大疾病的治疗方面,RNAi正显示出巨大的临床应用潜力,犹如给医药界带来了新鲜空气一样令人振奋.
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柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP部分序列的克隆及原核表达
目的 构建柔嫩艾美尔球虫病毒RNA依赖RNA聚合酶(RDRP)蛋白部分Ⅸ段的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白. 方法 根据柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因序列设计引物,以病毒基因组dsRNA为模板,RT-PCR扩增目的片段;扩增产物与pMD-18T克隆载体相连接,经测序鉴定序列正确后,将该质粒酶切,酶切目的片段与原核表达载体pET-28a连接构建原核表达质粒,转化入Transetta(DE3)中,经IPTG诱导表达重组蛋白,用SDSPAGE和Western blot分析目的蛋白表达. 结果 成功克隆柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因部分序列,其长度为1 330 bp,DNA测序表明重组原核表达质粒构建成功,推导的编码氨基酸序列与GenBank中布氏艾美尔球虫病毒RDRP氨基酸序列同源区段同源性为36％.经SDS-PAGE和Western blot分析,柔嫩艾美尔球虫病毒部分RDRP蛋白得到表达,表达蛋白的分子质量单位为52 ku,与理论值相符,且该重组蛋白可被His标签单克隆抗体识别. 结论 构建的重组原核表达载体pET 28a-RDRP在大肠埃希菌中高效表达柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP蛋白部分区段,为进一步研究该病毒奠定了基础.
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阴道毛滴虫病毒RDRP基因的克隆与分析
目的 对阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因的克隆,以便探讨其功能.方法 提取阴道毛滴虫总核酸为模板,根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TVV-T1序列设计一对引物,经RT-PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物,将其克隆到pMD-18T载体后测序,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析.结果 目的 基因片段长度为2 271bp,与阴道毛滴虫病毒T1株(U08999)的同源性高为85.2%.结论 国内首次成功克隆出阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因序列.
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RNA干涉及其应用
目的综述RNA干涉可能的作用机制及其在基因功能研究和基因治疗等方面的应用前景与展望.方法通过检索国内外文献资料进行分析、整理、总结.结果RNA干涉是由特定双链RNA(dsRNA)引起的转录后基因沉默现象.RNA干涉在基因功能研究和疾病基因治疗中已初步显示了其巨大优势.结论RNA干涉将是基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具.
