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云南省2例人感染H5N6禽流感病毒的基因特征研究
目的 分析云南省2例人感染H5N6禽流感病毒的基因特征,为将来的H5N6流感病毒的预防和控制提供科学依据.方法 采集云南省2例肺炎患者的咽拭子以及居住地禽类相关外环境标本,进行禽流感病毒H5N6的基因检测,并将阳性标本进行高通量测序以获得全基因组序列.利用MEGA软件进行序列比对,分析H5N6禽流感病毒HA基因的功能性位点变异情况,并构建HA基因系统发育树进行分析.结果 全基因组序列分析结果显示,云南省2例人感染H5N6禽病毒的8个基因片段序列同源性为98.5％～100.0％之间,与四川省、广东省的人感染H5N6禽流感病毒基因比对分析发现,除NP基因外,其他7个片段均有功能性位点的差异,导致其受体特异性改变、病毒毒力增强及耐药性改变.HA基因进化树分析显示,云南株、四川株及广州株同属于H5亚型2.3.4分支中的2.3.4.4亚支,云南省内外环境分离的6株禽类H5N6病毒与云南省2例人H5N6病毒及广州株有一定的亲缘关系,归于同一大簇.四川株与云南株及广州株有一定的遗传距离.结论 云南省H5N6禽流感病毒在遗传中存在着多样性和复杂性,病毒基因功能性位点的变异可以是引起禽流感病毒跨种传播的机制之一.因此,应动态监测活禽市场中的禽流感病毒的分布情况及基因变异特征,为研究禽流感病毒跨种传播提供研究资料,同时为云南省禽流感病毒的防控提供科学依据.
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黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株的分离鉴定及全基因组序列分析
收集吉林蜂场的蜜蜂蜂蛹病料的RNA作为扩增模板,依据GenBank公布的黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)的全基因组序列,自行设计了10对引物,运用RT-PCR首次获得中国BQCV毒株的全基因组序列,命名为中国BQCV-JL1株.其全基因组序列由8 358个碱基组成,与GenBank公布的其他6株BQCV毒株的全基因组序列相比,同源性为86％～93％.中国BQCV-JL1株ORF 1的位置为546 nt～4 676 nt(4 131 nt),ORF 2位于5 750 nt～8 203 nt,两个ORFs之间存在一段长为543 nt(4 891 nt～5 433 nt)的ORF3.中国BQCV-JL1株第一个基因功能区ORF1'的位置为546 nt～5 429 nt,包含ORF 1和ORF 3.在ORF2之前存在内部核糖体进入位点(IRES),其末尾3碱基为CCU(5 642 nt～5 644 nt),为促进ORF 2翻译的起始密码子,中国BQCV-JL1株第二个基因功能区ORF2'的位置为5 642 nt～8 203 nt.中国BQCV-JL1株与Hungary 10(EF517515)同源性高(93％),且分析核苷酸序列和氨基酸序列,与South Korea(JX149531)株接近,表明中国BQCV-JL1株与South Korea(JX149531)株均有可能来自欧洲.中国BQCV-JL1株与其他6株全基因组序列在ORF位置划分上存在差异,其原因是部分位置发生基因突变.
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云南省人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的变异分析
研究人乳头状瘤病毒16型E6和E7基因在云南省的变异情况.采集获得2 000例妇科门诊样品,提取DNA,以MY09/MY11为外引物,GP5+/GP6+为内引物,采用nest-PCR法对样品HPV-DNA高变区L1区的相应基因进行扩增、测序和分型,筛选得到20例HPV-16型病毒DNA,对其进行E6和E7基因特异性扩增,测序.结果显示20例HPV 16型E6基因中有10例在178位核苷酸发生碱基突变,突变频率为50％,E7基因中有10例在647位核苷酸发生碱基突变,突变频率为50％.进化树分析结果表明在云南省流行的HPV-16型中主要为亚洲变异型,没有发现非洲1型,非洲2型.
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云南省人类肠道病毒(EV)B组中新型EV80 EV81和EV83的分子生物学鉴定
目的 按文献报道的方法,对云南省4例急性弛缓性麻痹病例粪便标本的阳性病毒分离物进行分子生物学定型.方法 用肠道病毒(Enterovirus,EV)通用引物187/011、187/222扩增病毒基因组VP1区基因,直接对聚合酶链反应产物进行测序.所得序列在基因库进行Blast搜索,并与所有EV(包括新发现的EV)基因的相同区域进行比较.结果 4株病毒为EV80、EV81和EV83,为人类EV B组中的新型病毒.结论 运用分子生物学方法可以检测出传统方法所无法鉴定的血清型,并能提供病毒遗传学信息.
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超广谱β-内酰胺酶TEM和SHV型全长基因PCR直接测序
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)TEM和SHV型是常见的基因型,并且呈全球性分布.TEM和SHV的衍生型不断出现.TEM和SHV型全长基因测序对亚型的区别、新亚型的确认和各衍生型的基因进化树分析以及分子流行病学研究具有重要意义.本文介绍TEM和SHV型全长基因PCR直接测序方法.
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深圳地区小儿肠道病毒感染的核酸检测分析
为了解深圳地区肠道病毒(EV)的感染流行情况和病毒分型特征,我们采用检测EV的套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR)方法进行EV感染检测,并对临床分离株5′端非编码区(5′UTR)基因序列进行分子进化树分析.
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1型星状病毒上海分离株基因组序列测定及分析
目的 了解上海地区腹泻患儿感染的星状病毒基因组分子结构特点和基因型.方法 用RT-PCR方法分段扩增星状病毒基因组,克隆于pMD18-T载体上,测定序列并拼接,用MEGA、DNAStar软件对所得序列进行分析.结果 本次分离株基因组全长6807 bp,命名为HAstV-SH,提交到GenBank上的序列号为FJ375759,有3个开放阅读框架,非结构基因ORF1a、ORF1b共长4290 bp,位于基因组83～4372 nt之间;编码结构蛋白的ORF2基因全长2364 bp,位于基因组4764～6727 nt之间.与GenBank中星状病毒ORF2基因组序列同源性比较发现,HAstV-SH与1型星状病毒核苷酸同源性高(97%),与其他基因型的同源性为63%～70%.结论 上海地区儿童感染的星状病毒HAstV-SH属于1型星状病毒,与日本分离株AB009985亲缘关系较近,氨基酸同源性为97.5%.
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辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析
目的 分离鉴定2007年辽宁省蚊虫携带流行型乙型脑炎(乙脑)病毒及基因型别.方法 用细胞培养方法分离病毒,对致金黄色地鼠肾细胞系(BHK-21)细胞病变(CPE)的病毒进行逆转录-聚合酶链式扩增(RTPCR)检测;扩增的目标片段进行序列测定;用Mega3.1软件、以邻位相连法构建进化树.结果 共分离到22株病毒,RT-PCR检测结果表明,均为乙型脑炎病毒;随机选择其中3株病毒的基因序列进行基因型鉴定分析,均为Ⅰ型乙型脑炎病毒.3株病毒E基因编码结构域(Domain)区段分析结果显示,其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和100%;与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有12个氨基酸位点变异.结论 辽宁省蚊虫标本中分离的病毒均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其中E基因所编码Domain区E-327(S→T)位点发生的变异,提示在辽宁省首次分离到乙型脑炎病毒变异株.
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聚类技术在大样本序列进化树分析中的应用
目的 进化树分析是生物信息学研究的重要工具,但是目前结果比较精确的进化树方法计算量都很大,无法在大样本数据中直接应用.本文试图通过结合聚类分析和进化树分析的方法以解决此问题.方法 以甲型流感病毒的H3A1序列为例,首先使用两步聚类将数据进行拆分,随后按照类别分类构建进化树,并终将其拼接为完整的进化树结果.结果 序列的聚类结果与进化树结构间呈现出高度的一致性,各类别在时间上的更替规律在进化树中则呈现为各进化树节段的交替.结论 聚类方法与进化树方法相结合可以很好地满足大样本序列的进化树分析需求,如果在模型中加入其他参数,还可以使结果更为丰富,值得在该领域中推广.
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广州地区婴幼儿感染Noro病毒基因型的初步研究
目的 探讨广州地区婴幼儿腹泻中感染Noro病毒的基因型.方法 用Clustal W比对GⅡ组Noro病毒后,设计处于ORF 1与ORF 2连接点两旁两对简并引物,进行巢式RT-PCR扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列,对ORF1与ORF 2连接点两旁序列和衣壳蛋白N/S区用Clustal W进行同源性分析,用phylip 3.65软件、邻接法构建进化树.结果 标本NVgz100、NVgz10成功扩增出ORF 1与ORF 2连接点两旁1 208 bp片段(相对于Hawaii virus,U07611位置为4476-5683),包含ORF 1的3′端RdRp的大部分基因和ORF 2基因的5′端的S区.对标本NVgz100、NVgz10与另一实验NVgz01(DQ369797)的1 208 bp进行同源性分析发现,3份标本与G Ⅰ组同源性为58%～61%,与GⅡ组同源性为74%～92%;将这3份标本与G Ⅰ、GⅡ组构建进化树,可发现NVgz100、NVgz10和NVgz01与GⅡ组Bristol等病毒密切相关,将NVgz100、NVgz10和NVgz01的衣壳蛋白N/S区与GⅡ组各基因型进行同源性比较,发现3份标本与GⅡ-4基因型Camberwell、Bristoh Grimsby同源性较高(92%～96%),与其他基因型同源性为70%～73%,以N/S区构建进化树可发现3份标本与Camberwell、Bristol、Grimsby、Lordsdale处于同一簇中.结论 本实验结果表明Noro病毒株以GⅡ组为主,病毒流行的基因型为与Camberwell、Bristol、Grimsby和Lordsdale等密切相关的GⅡ-4基因型.F
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一株猪肺炎木糖氧化杆菌分离鉴定及系统进化树分析
目的 鉴定猪群体性肺部感染的病原菌.方法 采用生化鉴定、小白鼠致病性试验、16S rRNA PCR鉴定及系统进化树分析.结果 根据生化鉴定、小白鼠致病性试验及16S rRNA PCR鉴定.结果表明该菌为一株具有一定毒力的木糖氧化无色杆菌,同源性分析该菌与KF879922.1相似性为99.9％,命名为TLSY-1.结论 该菌的鉴定将为仔猪肺炎病原鉴定提供新的依据.
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长沙市首例人感染H9N2禽流感病毒的HA基因序列特征分析
目的 对长沙市首例人源H9N2禽流感病毒进行病毒分离与HA基因特征序列分析.方法 用细胞培养法在可疑病例标本中分离H9N2禽流感病毒毒株,RT-PCR方法扩增禽流感病毒HA基因全长并测序,对所得结果进行氨基酸同源性与进化树分析.结果 分离的毒株命名为A/Hunan/44558/2015,GenBank登录号为KX595338.毒株存在2处新发突变位点,HAT197D、HAD483N,第313位出现与湖南省人源H9N2毒株A/Lengshuitan/11197/2013相同的糖基化位点NCS.与A/Wild Chicken/Shanghai/C1/2014和A/Envionnment/ Hunan/28028/ 2014的同源性分别为97.9％和97.6％.进化树分析分离的毒株处于Y280分支.结论 发现病毒2处新的基因突变位点,与2014年湖南省环境源毒株同源性较高,存在基因交换重组,从分子水平揭示病毒HA基因的进化趋势.
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诺如病毒RT-PCR检测及进化树分析
目的:了解辽宁省儿童诺如病毒感染情况.方法:用RT-PCR的方法对131份粪便标本进行检测.扩增出的目标片段克隆于T载体上测定序列,用Mega3.1软件、邻位相连法构建进化树.结果:共有22份粪便标本诺如病毒RT-PCR检测阳性.通过核苷酸碱基序列比对发现这22株诺如病毒碱基序列与2006～2007年在匈牙利、荷兰和日本引起流行的参考株碱基序列高度同源,进化树分析表明它们共同构成GⅡ.4的一组新变异群;与欧洲食源性病毒监测网络诺如病毒数据库比较,发现它们与欧洲GⅡ.4新变异株2006b同源性高.结论:辽宁地区检测到的22株诺如病毒均属于GIL 4新变异株2006b.
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3起G Ⅱ.17型诺如病毒突发疫情的分子流行病学分析
目的 了解3起学校诺如病毒突发疫情的分子流行病学特征,分析诺如病毒疫情的基因型.方法 采用实时荧光定量反转录PCR检测标本诺如病毒RNA,阳性标本进行逆转录PCR扩增、电泳、测序和进化树分析.结果 3起学校疫情的17份肛拭子样本中,诺如病毒G Ⅱ型阳性12份.10株疫情病毒经序列测定和比对,均为G Ⅱ.17亚型;与来自GenBank数据库的G Ⅱ.17亚型NV参考株相似性均在98％以上;系统发生树上与G Ⅱ.17基因亚型在一个进化分支上,属于G Ⅱ.17基因亚型.结论 G Ⅱ.17型诺如病毒将是今后疾病预防控制机构进行长效监测和防控的重点.
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猪细小病毒SD-68株vp2基因的克隆及序列分析
对猪细小病毒(PPV)SD-68株vp2基因进行的克隆和序列测定表明:SD-68株VP2基因全长1740bp,编码579个氨基酸残基组成的多肽;PPV SD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2(5075)株、NADL-2(4973)株、US-1株的VP2基因比较,核苷酸的同源性在99%以上,氨基酸的同源性在96%以上.进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系近;在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),SD-68株与kresse株的差异小,据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似,即SD-68株属皮炎型PPV;而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现,215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点.
关键词： 猪细小病毒SD-68株 VP2基因 进化树分析 组织嗜性 致病性 -
广西首起诺如病毒感染性腹泻病原基因测序分析
目的 对广西首起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,以确证其病原体,并对其基因分型.方法 采用荧光定量PCR法对8份疫情病例样本进行诺如病毒RNA检测,取其中4份阳性标本再经RT-PCR扩增,然后纯化、克隆、测序和进化树分析.结果 8份标本均测出诺如病毒RNA,阳性率100%;其中4株病毒的N/S区序列与GenBank中的雪山病毒参考株同源性高,达95%.结论 序列测定结果证实广西大新县的急性胃肠炎疫情是诺如病毒感染所致,其病毒基因型为GⅡ.2型.
关键词： 诺如病毒 Real-time RT-PCR 进化树分析 -
长沙市2013-2016年HFMD重症病例肠道病毒谱及其基因特征
目的 了解2013年至2016年长沙市手足口重症病例感染柯萨奇病毒A组6型(CAV 6)和柯萨奇病毒A组10型(CAV 10)肠道病毒的流行趋势,并对其VP1基因进化概况进行分析.方法 运用描述性统计学分析方法对全市重症手足口病流行病学资料进行整理.CAV 6和CAV 10型肠道病毒阳性咽拭子、肛拭子或粪便标本用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP1基因片段,序列比对后用MEGA软件构建进化树.结果 2013-2016年全市共检测111份重症手足口病例标本,肠道病毒阳性标本80份,检出率为72.07％.80份肠道病毒阳性标本中,CAV 6型10株,CAV 10型8株.核苷酸序列的同源性分析发现,CAV 6型肠道病毒核苷酸序列之间存在0.8％～6.6％的差异.CAV 10型肠道病毒核苷酸序列之间存在1.1％～5.6％的变化差异.8株CAV 6型毒株均位于D2分支,1株处于D1分支.6株CAV 10型毒株位于E分支.结论 CAV 6和CAV 10肠道病毒在基因水平并未发生明显突变.重症病例中出现CAV 6型和CAV 10型感染高峰年份,但2016年有所降低,应将CAV 6和CAV 10型肠道病毒纳入常规监测,降低手足口发病风险.
关键词： 重症手足口病 柯萨奇病毒 进化树分析 柯萨奇病毒A组6型 柯萨奇病毒A组10型 -
成都地区婴幼儿腹泻诺如病毒感染研究
目的 探讨四川成都地区婴幼儿腹泻中诺如病毒(Norovirus,NoV)的流行状况及基因特点.方法 收集四川大学华西第二医院2009年9月～2011年5月的腹泻婴幼儿的粪便标本,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测NoV核酸,通过测序进行分型和进化分析,统计分析NoV感染与性别、年龄、季节和临床症状特点的关系.结果 485例粪便标本中,Nov阳性60例,其中GⅠ簇5例(占8.3％),GⅡ簇54例(占90.0％),混合感染1例(占1.7％)；12～24月龄儿童易感染,未见性别和季节差异；呕吐与NoV感染存在中等强度的关联；24株GⅡ簇NoV中,GⅡ-4基因型占79.2％ (19/24),GⅡ-3为16.7％ (4/24),GⅡ-2型占4.1％ (1/24)；19株GⅡ-4中,有8株为2006a变异株,11株为2006b变异株；另外,4株NoV的重组分析显示并未发生重组现象.结论 2009年12月～2011年5月期间,NoV是引起成都地区婴幼儿非细菌性腹泻的主要病原体之一,GⅡ-4基因型(包括2006a和2006b变异株)为优势毒株,研究发现的一株GⅡ-2型NoV国内未见报道,因此应对成都地区儿童的NoV感染进行长期监测和病原分析.
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一株引起病毒性脑炎的柯萨奇B组5型病毒全基因组分析
目的 对一株病毒性脑炎病原柯萨奇病毒B5 (coxsackievirus B5,CV B5)分离株KMA2/YN/CHN/2010的全基因组及其遗传特性进行分析.方法 对297份病毒性脑炎患者脑脊液在RD细胞进行病毒分离;提取病毒RNA,采用RT-PCR移步法分段扩增CV-B5全长基因,经测序和拼接后,利用MEGA7.0和SimPlot 3.5.1等软件进行分析.结果 通过分离获得一株阳性分离株,经鉴定为CV-B5 KMA2/YN/CHN/2010株,其基因组全长为7 395 bp,编码含2 185个氨基酸残基的多聚蛋白.与其他CV B5病毒分离株的全基因组的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6％～98.8％和93.1％～98.1％;KMA2/YN/CHN/2010与其他CV-B5株在各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为75.0％ ～ 100.0％和88.8％～ 100.0％.其中与A210/KM/09株同源性高.进化分析发现CV B5分4个基因型,KMA2/YN/CHN/2010属于C基因型.通过重组分析发现KMA2/YN/CHN/2010可能为重组株.结论 KMA2/YN/CHN/2010与其他中国株一样同属于C基因型.
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2017年长沙地区两株新型H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特征分析
目的 从分子水平对长沙市新型H7N9禽流感病毒株进行基因特征分析,揭示禽流感病毒的变异情况.方法 2株毒株经逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcript-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法扩增血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因片段,进化树分析氨基酸关键位点.结果 氨基酸分析显示2株毒株(A/Changsha/26/2017和A/Changsha/41/2017)受体结合位点为G195V和Q235L.多个氨基酸位点发生新的突变,包括A130T、S136N、R148K和M245I (Ⅴ).NA基因中耐药性位点K294R,未发生变异.进化树研究表明,HA基因与2017年广东省分离的3株毒株共为一个分支,并单独分为一个亚支.NA基因遗传距离近的是A/Chicken/Ganzhou/GZ79/2016.结论 长沙市出现的H7N9禽流感病毒株已进化为一个单独分支,为高毒力新型H7N9病毒株,需加强禽流感病毒的防控力度,预防人群的感染.
