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荧光定量RT-PCR检测柯萨奇病毒A组6和10型的方法建立及应用
目的 建立柯萨奇病毒A组6(Coxsackievirus A6,CVA6)和10型(CVA10)的SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR方法并进行评价及初步应用.方法 根据GenBank上的CVA6和CVA10序列,分别设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法体系,并分别进行灵敏度,重复性和特异性检测,然后利用该方法对649份2014年天津市未明确分型的肠道病毒阳性标本进行检测.结果 成功建立CVA6和CVA10的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法及定量标准曲线,其检出限均为101 copies/μL,重复性实验的变异系数均小于2％.该方法特异性强,与柯萨奇病毒(A组2、4、5、16型)、肠道病毒EV71型、诺如病毒、轮状病毒、麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应.利用该方法检测649份未分型标本,发现136份为CVA6阳性和174份为CVA10阳性,分别占未分型阳性标本的20.96％和26.81％.结论 本研究建立的检测CVA6和CVA10荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好、特异性强,应用于2014年天津市手足口病监测,发现C VA6和CVA10已成为优势型病原体.
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2016年湖北省部分地区手足口病肠道病毒病原谱及柯萨奇病毒A6型和A10型基因特征分析
目的 了解2016年湖北省部分地区手足口病病原谱特征,对其中的柯萨奇病毒A组6型(Cox A6)和A组10型(Cox A10)基因特征进行分析.方法 采集2016年湖北省部分地区手足口病患者阳性标本,提取病毒核酸,通过一步法反转录-PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型.对其中Cox A6和Cox A10的VP1全长序列进行同源性和系统进化分析.结果 病原学监测结果显示,肠道病毒71型(EV71)阳性率为29.4％ (599/2 035),柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)阳性率为25.7％ (522/2 035),其他肠道病毒阳性率为44.9％ (914/2 035).对该地区收集的83份肠道通用阳性的非EV71和非Cox A16进行病毒分型分析,Cox A6阳性检出率为56.6％ (47/83),Cox A10阳性检出率为22.9％ (19/83),还检测出其他肠道病毒如Cox A2(2株)、Cox A4(7株)、CB4(2株)、CB5(2株)、CB6(1株)、Echo5(1株)、Echo9(1株)和Echo25(1株).对Cox A6和Cox A10的VP1基因同源性比对及系统进化分析显示,2016年湖北省22株Cox A6的VP1基因核苷酸同源性为95.1％ ～ 100.0％,11株Cox A10的VP1基因核苷酸同源性为95.2％ ～ 100.0％.我国与其他国家Cox A6和Cox A10可分别划分为8个(A～H)和7个基因谱系(A ～G).湖北省Cox A6与我国其他Cox A6位于H基因谱系上;湖北省Cox A10与我国其他Cox A10位于G基因谱系上.结论 2016年湖北省部分地区手足口病病原体除了EV71和Cox A16两种主要病毒外,还检测出Cox A6和Cox A10等手足口病的病原.其他肠道病毒中以Cox A6和Cox A10为主,仍需进一步加强对其他肠道病毒的监测和分子流行病学特征的分析.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组6型 柯萨奇病毒A组10型 VP1基因 基因特征 -
2008-2013年湖北省十堰地区手足口病病原谱动态分析
目的 分析十堰地区手足口病病原谱构成及其动态变化,为该病的预防控制提供参考.方法 2008年5月至2013年12月,从十堰市各县(市、区)收集2076例手足口病临床诊断病例标本,用一步法反转录聚合酶链反应(one-step RT-PCR)和实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)法进行手足口病毒核酸检测并分型,结合病例基本信息,对判定为手足口病的确诊病例,采用描述流行病学方法进行病原谱动态分析.结果 2008-2013年,肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组(Cox A16、Cox A6、Cox A10)及其他型人肠道病毒(EV)在手足口病确诊病例中的病原构成比依次为46.35％ (24.19％～62.23％)、38.12％(13.06％ ～ 70.97％)、5.99％ (0 ～ 13.06％)、3.75％(0～8.28％)和5.79％(1.37％ ～ 15.12％).Cox A10与Cox A10致病对象为≤5岁婴幼儿;4-6月出现夏季流行高峰,10-11月出现冬季流行小高峰;各县(市、区)流行的手足口病毒均在4种以上,Cox A6所占比例持续上升,2013年达到13.06％.结论 2008-2013年十堰地区手足口病流行较为严重,病原体包括EV71、Cox A16、CoxA6、Cox A10等多种型别肠道病毒,EV71与Cox A16逐年交替维持着优势地位,Cox A6近2年有持续上升的趋势值得关注.国家在今后的疫情防控、疫苗策略和临床管理中,应高度重视手足口病持续流行过程中病原谱的变化.
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宁夏回族自治区2013年手足口病患者柯萨奇病毒A组10型分离株VP1区基因特征分析
目的：了解宁夏回族自治区（宁夏）手足口病（HFMD）患者中柯萨奇病毒A组10型（Cox A10）分离株的VP1区基因特征。方法收集2013年real-time PCR 检测非EV71和非Cox A16肠道病毒标本280份，用RD细胞进行肠道病毒分离培养，分离到的毒株采用RT-PCR扩增其VP1区基因并进行核苷酸序列测定，测序结果利用BLAST进行型别鉴定。对鉴定为Cox A10的所有毒株进行VP1区基因同源性分析和进化分析。结果从280份标本中共分离到肠道病毒36株，其中有6株鉴定为Cox A10，核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%～99.8%和99.0%～99.7%。与A、B、C、D各基因亚型代表株之间的核苷酸同源性分别为76.3%～77.2%、81.6%～83.1%、94.4%～98.9%和80.0%～82.3%，氨基酸序列同源性分别为92.3%～93.0%、94.0%～95.3%、98.0%～99.7%和90.6%～94.0%。系统进化显示，6株Cox A10宁夏株与C基因型代表株处于同一分支。结论 Cox A10是引起宁夏2013年HFMD的常见病原体，本次分离到的Cox A10均属于C基因型。
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组10型 基因特征 -
甘肃省2013～2016年手足口病病原学监测分析
本研究对甘肃省2013～2016年手足口病病原监测结果进行分析,以了解甘肃省这几年病原谱的构成,主要病原的流行特点,为进一步做好手足口病防控工作提供依据.2013～2016年,甘肃省监测网络实验室对7 171份标本进行了核酸检测,对其中3373份阳性标本开展了病毒分离培养,对得到的阳性分离株进行全长VP1区核苷酸序列测定及其分子特征分析.检测到核酸阳性标本4 314份,EV71为1 153份,占病原构成的27.73％,CVA16为1 452份,占33.66％,其他肠道病毒为1 709份,占39.62％.重症病例124例,阳性97例,其中EV71为23例,占病原构成的23.71％,CVA16为9例,占9.28％,其他肠道病毒为64例,占65.98％,EV71+CA16混合型为1例,占1.03％;死亡病例2例,均为EV71.2013年以其他肠道病毒为主要病原,占36.76％(347/944);2014年以CVA16为主,占52.83％(625/1 183);2015年和2016年均以其他肠道病毒为主,分别占57.04％(531/931)和48.25％(606/1 256).分离到的病毒株除了EV71和CVA16,其他肠道病毒以CVA6、CVA10和CVA4为主.2013～2016年中,不同年份流行的病原不尽相同,不同地区流行的主要病原也存在地区差异.对流行的几种主要病原的VP1区分析结果表明:C4a基因亚型EV71在甘肃省仍然持续流行;CVA16的流行则是B1b基因亚型占据优势,B1a基因亚型逐渐消失;甘肃省流行的CVA6和CVA10与国内流行的毒株亲缘关系相近,且存在不同的传播链.
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2010年上海部分地区440例手足口病病例的病原谱及分子流行病学分析
本文旨在对上海部分地区2010年440例临床手足口病病例进行病原谱及分子流行病学特征分析,为上海地区手足口病防治工作提供依据.采集4所哨点医院440例手足口病病例的咽拭子、粪便和脑脊液标本,进行肠道病毒核酸检测、反转录-聚合酶链反应扩增、DNA测序和序列分子系统发生树分析.结果显示,引起手足口病的肠道病毒主要为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16),其次为CA6和CA10.夏季(5～8月)为EV71和CA16感染的高发期.CA6和CA10阳性病例构成比随季节而变化,冬季达高峰.病毒的VP1基因序列分析显示,病例标本中的EV71均属CAa亚型,与国内近年各地流行株高度同源；而本研究中10例上海病例的CA6序列与2008年导致芬兰手足口病疫情的毒株有高度的核苷酸同源性(＞96％),CA10序列与2009年山东和2010年云南代表株为接近,在系统发生树中分布于亚洲毒株基因簇.本研究提示,应重视对上海地区导致手足口病的非EV71非CA16肠道病毒的监测,深入分析CA6和CA10的流行趋势,以防范其快速传播.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组6型 柯萨奇病毒A组10型 -
检测柯萨奇病毒A组6、10、16型的多重荧光RT-PCR建立及应用
目的 建立检测手足口病(HFMD)肠道病毒的多重荧光RT-PCR方法.方法 用多重荧光RT-PCR技术对引起HFMD的3种常见人肠道病毒[柯萨奇病毒A组(CVA)6、10、16型]进行检测,用基因测序法进行验证,并以灭活的CVA6、CVA10、CVA16病毒标准株以及引起临床相似症状的病原体样本进行特异性和灵敏度分析.结果 322例临床疑似HFMD标本,经本多重荧光RT-PCR法检测出CVA16、CVA10和CVA6型阳性样本分别为81、16和9份(总阳性率32.9％),且与基因测序法结果完全符合.将多重PCR体系中c-MMLV逆转录酶的量增至5U,Hot-Taq酶的量增至8.5U,可使其扩增效率提升至单重PCR扩增水平.优化后的体系可扩增出CVA6、CVA10和CVA16型阳性病毒标准RNA的检测下限分别是10,5和1 TCID50/mL.结论 建立了一种灵敏、特异、高效和高通量的检测HFMD肠道病毒的多重荧光RT-PCR法,为其快速诊断提供了新的实验方法.
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2013年湖南省郴州市手足口病病原学及柯萨奇A6和A10基因特征分析
目的 了解2013年湖南省郴州市手足口病病原学特征及不同分离株基因特征,为郴州市手足口病的防治提供科学依据.方法 采集2013年郴州市手足口病监测病例标本,应用荧光PCR法检测EV71、CVA16、CVA6、CVA10和其他肠道病毒.未能分型的其他HEV阳性标本进行RT-PCR扩增,通过基因测序鉴定病原体型别.结果 共检测772份标本,阳性检出率为66.71％,其中CVA6为41.55％;CVA10为15.92％;CVA16为13.01％;EV71为5.63％;其他肠道病毒为23.88％.不同年龄、月份和病例类型的病毒型别构成比差异均有统计学意义(P＜0.05).重症和聚集性病例以其他肠道病毒感染为主.基因序列分析显示:CVA6郴州株与邻近的长沙株亲缘关系近;CVA10郴州株与国内各分离株亲缘关系均较近.结论 CVA6和CVA10是2013年郴州市手足口病流行的主要病原体,日常监测中仅检测EV71和CVA16已不能满足手足口病防控需要.CVA6和CVA10都具有明显的地域分布特征,国内的CVA6毒株相对容易变异,而CVA10毒株相对比较保守.
关键词： 手足口病 病原学 柯萨奇病毒A组6型 柯萨奇病毒A组10型 序列测定 -
长沙市2013-2016年HFMD重症病例肠道病毒谱及其基因特征
目的 了解2013年至2016年长沙市手足口重症病例感染柯萨奇病毒A组6型(CAV 6)和柯萨奇病毒A组10型(CAV 10)肠道病毒的流行趋势,并对其VP1基因进化概况进行分析.方法 运用描述性统计学分析方法对全市重症手足口病流行病学资料进行整理.CAV 6和CAV 10型肠道病毒阳性咽拭子、肛拭子或粪便标本用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP1基因片段,序列比对后用MEGA软件构建进化树.结果 2013-2016年全市共检测111份重症手足口病例标本,肠道病毒阳性标本80份,检出率为72.07％.80份肠道病毒阳性标本中,CAV 6型10株,CAV 10型8株.核苷酸序列的同源性分析发现,CAV 6型肠道病毒核苷酸序列之间存在0.8％～6.6％的差异.CAV 10型肠道病毒核苷酸序列之间存在1.1％～5.6％的变化差异.8株CAV 6型毒株均位于D2分支,1株处于D1分支.6株CAV 10型毒株位于E分支.结论 CAV 6和CAV 10肠道病毒在基因水平并未发生明显突变.重症病例中出现CAV 6型和CAV 10型感染高峰年份,但2016年有所降低,应将CAV 6和CAV 10型肠道病毒纳入常规监测,降低手足口发病风险.
关键词： 重症手足口病 柯萨奇病毒 进化树分析 柯萨奇病毒A组6型 柯萨奇病毒A组10型 -
上海市普陀区2013年手足口病病原学监测结果分析
目的：了解2013年上海市普陀区手足口病的病原学特点，为手足口病的防控提供实验室依据。方法采用实时荧光定量PCR对366例疑似手足口病患者的咽拭子、疱疹液和肛拭子进行肠道病毒通用核酸(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、柯萨奇病毒A组10型(CA10)和柯萨奇病毒A组6型(CA6)基因检测。结果引起手足口病的肠道病毒主要为柯萨奇病毒A组6型(CA6)和肠道病毒71型(EV71)，366例手足口病者中肠道病毒通用核酸阳性者273例(74.59%)，柯萨奇病毒A组6型(CA6)阳性者169例(46.17%)，肠道病毒71型(EV71)阳性者58例(15.85%)，柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)阳性者18例(4.92%)，柯萨奇病毒A组10型(CA10)阳性者8例(2.19%)。结论2013年上海市普陀区手足口病者的病原学特点以CA6为主，占46.17%；EV71次之，占15.85%。提示上海市普陀区手足口病病原体组成复杂，应深入分析CA6的流行趋势，加强手足口病病原谱监测，为手足口病防治提供实验室依据。
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2014-2016年昆明市手足口病非EV-A71、非CV-A16肠道病毒流行情况及基因特征
目的 探讨2014-2016年昆明市引起手足口病的非EV-A71、非CV-A16肠道病毒的病原构成及优势型别基因特征,从而为本地区手足口病防治提供科学依据.方法 收集2014-2016年昆明市手足口病病例标本3 767份,应用Real-time PCR法检测非EV-A71、非CV-A16肠道病毒并用RT-PCR方法扩增其阳性分离株的VP1基因片段,对扩增产物进行测序.利用序列结果进行型别鉴定,分别与各型代表株进行核苷酸、氨基酸同源性比较,构建系统进化树.结果 2014-2016年共检测标本3 676份,检出908份非EV-A71、非CV-A16肠道病毒核酸阳性病例标本,其中CV-A6型545例,CV-A10型158例,未分型205例.与引起手足口病的肠道病毒流行特征一致,非EV-A71、非CV-A16肠道病毒高发季节为4-7月;发病人群以6岁及以下儿童为主,尤以1～3岁儿童发病率高;男、女病例比例为1.65∶1,男性明显高于女性.进化分析显示,昆明市CV-A6型和CV-A10型肠道病毒的VP1序列与其各自的原型株同源性相对较低,与国内分离株有较高同源性.结论 2014-2016年昆明市的非EV-A71、非CoxA16型肠道病毒型别多样,优势型别主要是CV-A6型,处于F4亚分支;其次是CV-A10型,为C基因型.
关键词： 手足口病 流行特征 进化分析 柯萨奇病毒A组6型 柯萨奇病毒A组10型 -
柯萨奇病毒A组10型研究进展
自2008年以来,由多种肠道病毒引起的手足口病已成为严重威胁中国婴幼儿健康的重大公共卫生问题之一.其中,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病的主要病原体.但2011年以后,中国手足口病的流行趋势发生了变化,柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)引起的手足口病呈增多趋势,在部分地区已替代EV71和CVA16成为引起手足口病的主要病原体,已引起越来越多的关注.现就CVA10的病原学、流行病学、实验室诊断、动物模型及疫苗相关研究作一综述.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组10型 病原学 流行病学 疫苗 -
我国大陆地区柯萨奇病毒A组10型流行株基因特征分析
目的 分析我国大陆地区柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)流行株基因结构及引起重症手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)毒株的序列特征.方法 从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库下载我国大陆地区各省份或地区不同年份的流行株序列信息,使用MEGA 5.2软件构建系统进化树,应用Simplot软件进行重组分析,应用MegAlign软件对引起厦门2015年重症手足口病暴发的毒株进行比对分析.结果 我国大陆地区在2010年之前曾有Lineage C毒株流行,2010年之后流行的毒株均属于Lineage E,且表现为E2和E3毒株共同流行的趋势.未见已报道的CV-A10大陆流行株与其他血清型人类肠道病毒发生重组.引起不同症状的毒株在序列同源性上未见显著差异,而引起厦门2015年重症HFMD暴发的毒株在5'-UTR区128～130位点处存在3个核苷酸位点(ACT)缺失.结论 应加强CV-A10的监测和流行病学研究,为CV-A10疫苗及多价HFMD疫苗的研发奠定基础.
关键词： 柯萨奇病毒A组10型 基因组 重组
