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蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析
用RT-PCR扩增我国蓝舌病毒Z1株的VP7基因,直接将其克隆至pGEM-T载体中,用限制性内切酶EcoRⅠ分析经蓝/白斑筛选和PCR鉴定的重组质粒,用DIG标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Northern blot杂交,证明插入片段为BTV VP7基因特异性片段.采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的9株蓝舌病毒及相关的环状病毒的VP7基因进行了比较分析,结果表明:国内BTV Z1株的VP7基因的核苷酸序列与上述9个毒株的同源性在71.4%～98.7%之间,与USA BTV-10株的同源性高,与AUS BTV-15株的同源性低.该研究对于我国蓝舌病基因工程疫苗的研制及对该病分子流行病学的调查有着重要意义.
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EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒的制备及表达
目的:构建EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒,研究EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗.方法:利用RT-PCR扩增出EB病毒B95.8株潜伏期膜蛋白2A(LMP2A)全部编码蛋白的基因,并克隆至pGEM-T载体中.并将LMP2A cDNA插入E1、E3区替代的腺病毒载体pAX1CW,选择正确的克隆pAX1CW-LMP2A与Ad5 DNA-末端肽复合体共转染293细胞,通过同源重组获得复制缺陷型的重组腺病毒.提取重组腺病毒转染的293细胞DNA,通过酶切初步鉴定.选择阳性克隆感染CV1细胞,通过流式细胞仪和激光共聚集显微镜分析LMP2A蛋白表达情况.结果:挑选同源重组17个克隆中有9个为阳性克隆,扩增到的病毒滴度为2.3×108 pfu/ml.用MOI=100的重组腺病毒感染CV1细胞,48 h后在激光共聚焦显微镜下可见LMP2A蛋白表达于CV1细胞膜上,经流式细胞仪检测LMP2A蛋白表达阳性细胞数为94.4%.结论:重组腺病毒能有效地介导LMP2A基因的表达,为进一步研究该基因功能及其工程疫苗打下了基础.
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爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A cDNA的克隆及序列分析
目的:克隆爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)潜伏期膜蛋白2A(LMP2A)基因,进一步研究其基因工程疫苗.方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出EBVB95.8株LMP2A全部编码蛋白的基因,并克隆至载体pGEM-T中,通过α-插入失活、PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒;采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列.结果:克隆出LMP2A第1个外显子到第8个外显子的全部编码蛋白的cDNA,测序结果与EB病毒B95.8原型株LMP2AcDNA作同源比较,完全一致.结论:本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段.
关键词： 爱泼斯坦-巴尔病毒 潜伏期膜蛋白基因 逆转录-聚合酶链反应 克隆与鉴定 序列分析
