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表达轮状病毒VP7基因重组腺病毒载体的构建及免疫活性研究
目的 包装表达轮状病毒VP7基因的重组腺病毒,并检测其免疫活性.方法 RT-PCR扩增病毒结构蛋白VP7基因,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,并用RT-PCR和Western blot检测.将包装好的腺病毒免疫小鼠,应用间接ELISA检测小鼠血清中特异性轮状病毒IgG抗体.结果 酶切和测序鉴定证实成功构建携带VP7基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中成功包装病毒;RT-PCR和Western blot 均能特异检测VP7基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后可诱导针对轮状病毒的特异性免疫.结论 重组腺病毒的成功包装,为新型轮状病毒基因疫苗的研制提供了一种可行的途径.
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2007-2012年哈尔滨地区G1型A组轮状病毒VP7基因变异分析
目的 了解哈尔滨地区G1型A组轮状病毒VP7基因变异特点.方法 选取2007-2012年哈尔滨地区33株G1型A组轮状病毒标本,采用半巢氏PCR进行G1型鉴定,并对VP7基因进行克隆测序.采用DNASTAR软件对序列进行分析及进化树的绘制.结果 33株哈尔滨地方株VP7基因均为1062个碱基,推导氨基酸序列同源性95.7％～100％;33株哈尔滨地方株根据进化树分为四簇,其中Ⅰ簇17株,Ⅱ簇12株,Ⅲ簇、Ⅳ簇各2株.在氨基酸水平上,Ⅰ簇与其他三簇的整体差异位点为aa75(V→I),Ⅱ簇哈尔滨地方株变异比较活跃,Ⅱ簇、Ⅲ簇哈尔滨地方株具有一定的中国地方性,Ⅳ簇参考株均来自东南亚地区;2007年的哈尔滨地方株VP7蛋白变异位点多,2008年次之,2010年-2012年哈尔滨地方株主要集中在Ⅰ簇.结论 33株轮状病毒G1型哈尔滨地方株可分为四个分支,Ⅰ簇是优势分支,且随着监测年份的变化Ⅰ簇所占构成比逐渐增加.
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一起新生儿病毒性腹泻病原学分析
目的 查明引起新生儿病毒性腹泻疫情的病原并对其进行分子生物学特征分析.方法 采用金标法检测轮状病毒抗原,采用乳胶凝集法检测腺病毒;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测粪便样品中的轮状病毒核酸;利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒和扩增轮状病毒VP7基因并测序;利用DNAstar和Blast软件对测序结果进行分析.结果 11份样品中,金标法检测到轮状病毒阳性样品9份,阳性率为81.82%;腺病毒和肠道病毒检测均为阴性;PAGE法检测到10份轮状病毒阳性样品,电泳带型为4-2-3-2的样品有8份,阳性率为72.73%,另2份阳性样品的电泳条带特殊;8份带型为4-2-3-2的阳性样品均能通过RT-PCR扩增出VP7基因,选择其中3份样品进行测序,测序结果经过比对发现这3个毒株的核苷酸的同源性为99.90%,氨基酸的同源性为100%,与G1型标准株Wa的核苷酸同源性分别为91.30%～91.50%,氨基酸同源性为94.80%;与泰国流行株Thai-2104亲缘关系近,与中国以前的流行株处于不同的进化分支上.结论 引起此次新生儿病毒性腹泻疫情的病原是A组轮状病毒,PAGE带型主要为4-2-3-2,其血清型为G1型.
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宁波地区新生儿轮状病毒VP7基因序列分析
目的 研究宁波地区新生儿轮状病毒流行株VP7基因的分子生物学特点以及遗传变异规律.方法 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测新生儿病毒性腹泻便样中的轮状病毒核酸;选择特殊电泳带型样品通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP7全基因并测序;测序结果利用DNAstar和Blast软件进行比对.结果 通过PAGE发现11份样品中有9份阳性样品,其中带型为4-2-3-2的有7份,带型为3-2-2-2和4-2-1-2的各1份.3种带型各选一株进行VP7基因的扩增并测序,测序结果经分析发现,06NB3和06NB9与G1型标准株Wa的核苷酸同源性为84.4 % 和91.5%,氨基酸同源性分别为87.4% 和94.8%,06NB2与 G3型标准株YO的核苷酸同源性为95.3%,氨基酸的同源性为 96.6%.结论 宁波地区在新生儿中有A组轮状病毒流行,其电泳带型以典型的4-2-3-2为主,也可见特殊带型.06NB3和06NB9的VP7基因片段属G1型,06NB2则属于G3型.06NB3与国内外近几年流行的G1型毒株基因序列有较大差异,06NB9和06NB2则差异较小.
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南京地区2012～2013年G9型轮状病毒VP7基因特征的分析
A组轮状病毒是引起成人和婴幼儿急性腹泻的主要病原.了解轮状病毒流行株的型别,对主要中和抗原VP7的编码基因进行遗传变异分析,可为当地轮状病毒疫苗的应用和开发提供指导.我们对2012年10月至2013年12月南京地区908例腹泻门诊患者的粪便标本进行轮状病毒检测,采用RT-PCR方法对随机抽取的50份阳性标本进行G分型,并对其中19份G9型轮状病毒的VP7基因序列测序分析.结果发现轮状病毒阳性率11.34％(103/908),其中以G9型为主,占78.0％(39/50),其次是G2、G1和G3型.对G9型轮状病毒VP7基因核苷酸序列进行分析,显示主要分为G9-Ⅵ亚型和G9-Ⅲ亚型,以G9-Ⅵ亚型为主,且属于中国和日本G9型轮状病毒亚簇,部分毒株在A、B、C、F四个中和抗原表位中有变异,这可能有助于G9型轮状病毒的流行,值得引起注意.
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在中国卢龙县发现G5型人A组轮状病毒
轮状病毒是引起我国儿童重症腹泻的主要病原.按照WHO轮状病毒监测方案,对2003年间河北省卢龙县开展了以医院和社区为基础的小于5岁儿童轮状病毒腹泻的监测,发现一株新型轮状病毒.该病毒用传统分型引物(G1、G2、G3、G4)扩增不出条带,对其VP7基因全序列测定和分析后确定该毒株为G5型.这是我们在亚洲首次发现的人类G5型轮状病毒.该毒株与猪的G5型C134毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.6%和95.4%,与非洲发现的人的G5型毒株MRC3105核苷酸和氨基酸的同源性为89.9%和94%,与巴西发现的IAL-28毒株核苷酸和氨基酸的同源性为87.2%和93.3%.系统发生树分析表明:卢龙毒株LL36755与其他已经报告的两种猪和一种人类的G5型毒株可能具有相同的起源.这是人轮状病毒G5型首次在亚洲国家发现,而且该毒株可能是由人类轮状病毒与动物轮状病毒毒株自然重组产生.
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长春地区轮状病毒流行株VP7基因的遗传变异
A组轮状病毒是引起婴幼儿秋冬季病毒性腹泻的主要病原.目前没有有效的治疗药物,应用安全而有效的疫苗是控制重症腹泻的首要措施.对当地A组轮状病毒流行株的主要中和抗原VP7的编码基因进行遗传变异分析,可以为疫苗的应用和开发提供有益的指导.利用ELISA方法对长春地区1999～2005年的腹泻患儿标本检测A组轮状病毒,RT-PCR方法对阳性标本进行G血清分型,发现长春地区2001年以后流行的轮状病毒以G3型血清为主.选取1999～2005年的G3型轮状病毒标本31份,对其VP7基因进行扩增、克隆、测序,经过计算机分析比对,31株G3型轮状病毒VP7基因核苷酸序列没有显著差异.同一流行季节的毒株具有较相似的遗传变异特征.在2003年轮状病毒流行季节内,有6株G3型分离株的VP7基因在碱基1 038位置上出现一个碱基缺失.毒株发生在A、B、C三个高变区的碱基突变,位点相同或者位置临近.2002年以后毒株的基因突变增加,非高变区的碱基变异增加,这可能有助于维持G3型轮状病毒成为流行株.有规律的变异多发生在高变区,但是非高变区的非连续性变异的增加值得引起注意.
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蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析
用RT-PCR扩增我国蓝舌病毒Z1株的VP7基因,直接将其克隆至pGEM-T载体中,用限制性内切酶EcoRⅠ分析经蓝/白斑筛选和PCR鉴定的重组质粒,用DIG标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Northern blot杂交,证明插入片段为BTV VP7基因特异性片段.采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的9株蓝舌病毒及相关的环状病毒的VP7基因进行了比较分析,结果表明:国内BTV Z1株的VP7基因的核苷酸序列与上述9个毒株的同源性在71.4%～98.7%之间,与USA BTV-10株的同源性高,与AUS BTV-15株的同源性低.该研究对于我国蓝舌病基因工程疫苗的研制及对该病分子流行病学的调查有着重要意义.
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轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究
目的 研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株VP7基因的遗传特征,为疫苗的质量控制和发展提供依据.方法 将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代.提取第38、43、44、49代病毒RNA.通过RT-PCR扩增VP7基因片段,将其克隆人质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析.结果 LLR株VP7基闪全长1 062 bp,含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF).各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBanK中LLR参考株(L11602)同源性分别为99.9%和99.7%.与14株G10血清型RV毒株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.3%～87.4%和92.7%～94.9%;与不同血清型RV代表株间,VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62.2%～76.8%和72.9%～83.1%;在A、B、C 3个重要抗原表位,LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97.5%,而与不同血清型仅为42.5%～62.5%.结论 轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性,与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异,在遗传上密切相关,从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的.
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兔轮状病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达兔轮状病毒VP7基因.方法 根据GenBank发表的LaRV 308/01 VP7基因序列(AF5028201),设计一对特异性引物,RT-PCR扩增获得VP7基因,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体6pFastBHa-VP7.将重组转移载体转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-VP7,通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9.结果 获得了重组杆状病毒Bacmid-VP7,Westernblot和IFA分析表明VP7蛋白在昆虫细胞中获得正确表达且表达产物具有抗原性.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达兔轮状病毒VP7蛋白,为进一步建立诊断学方法奠定了实验基础.
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B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白并制备其兔抗血清.方法:根据B组轮状病毒(GBRV)WH-2株vp7基因的全序列设计引物,用PCR的方法扩增得到vp7基因的编码区.将其克隆到原核GST融合表达载体pGEX-KG内,转化大肠杆菌E. coliDH5α,IPTG诱导表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白,经SDS-PAGE分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白抗血清.结果:经鉴定确认,vp7基因以正确的方式插入到载体中,此重组表达载体经IPTG诱导后,可表达相对分子量为53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白.制备的抗血清经同样诱导表达的表达载体pGEX-KG表达产物吸收后1:500倍稀释后用Western Blot分析,与53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白获得特异性显色信号.结论:人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达,所表达的蛋白和制备的抗体不但为研究结构与功能提供了物质基础,也为GBRV所引起的疾病预防、诊断和治疗等流行病学研究和临床诊断奠定了基础,具有重要实际应用价值.
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表达轮状病毒G2和G3型vp7基因重组腺病毒的免疫效果
为探索以非复制型腺病毒为表达载体的多价轮病毒(Rotavirus,RV)基因工程疫苗的可行性,在前期工作的基础上,对表达我国G2和G3型毒株νp7基因的重组腺病毒的免疫效果进行了研究.分别用表达G2和G3型的νp7基因的重组腺病毒rvAdG2vp7、rvAdG3VP7经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体、黏膜抗体和相关的细胞因子水平进行了检测和比较。结果表明,用表达G2和G3型νp7基因的管理费用腺病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠后,可诱导机体产生较强的RV特异性免疫反应,名手体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫,并能产生中的抗体.但免疫反应以Th1类反应也占有相当的比例.本研究为新型RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础.
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人轮状病毒结构蛋白VP7基因毕赤酵母表达质粒的构建
[目的]构建人轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA. [方法]从VP7-pET32a质粒中PCR扩增轮状病毒VP7基因,EcoR I、Xba,I双酶切VP7基因产物和酵母表达载体pPICZαA,T4 DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,转化到大肠杆菌Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和测序鉴定. [结果]阳性克隆菌经酶切和PCR和测序鉴定,结果与预期相符,目的基因正确插入pPICZαA中. [结论]成功构建轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA,为轮状病毒结构蛋白VP7基因的酵母表达奠定了重要的实验基础.
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鼠源轮状病毒vp7基因的表达载体构建及转基因植物的研究
目的构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp7的植物表达载体及植物转化研究.方法抗原基因vp7经PCR扩增后直接克隆到PUC-T载体,双酶切目的片断和植物表达载体,以T4连接酶将目的片断与载体相连接,电转化方式将重组质粒转入农杆菌.结果以重组农杆菌为介导将靶基因转入到马铃薯外植体.成功地将目的基因定向克隆到表达载体,并转入到农杆菌中;以农杆菌为介导获得抗性转基因马铃薯植株.结论通过PCR 检测,初步确定轮状病毒外壳蛋白基因vp7已成功地整合到马铃薯植株中.
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轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因在花生中遗传转化的研究
匆提高外源蛋白的表达量和简化分离纯化过程,使用植物油体表达载体,以花生子叶节为转化受体,通过农杆菌介导将轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因开展遗传转化的研究.从转化植株中随机选取11株表现Kan抗性植株进行PCR检测,结果有6株能扩增出特异性条带,阳性率为54.5％.对转基因植株进一步进行PCR-Southern 杂交分析,发现转基因植株中有6株PCR反应呈阳性,其中有3株PCR-Southern杂交有特异性目标带出现.结果表明,外源基因已经整合到了花生基因组上.该研究为以植物为载体生产廉价、高效的植物口服疫苗奠定了基础.
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哈尔滨市G9型A组轮状病毒VP7基因序列分析与探讨
目的 了解哈尔滨市G9型A组轮状病毒与国内外部分地区G9型毒株VP7基因序列遗传与变异的差异,丰富我国G9型A组轮状病毒VP7基因序列的基础资料.方法 通过一步法RT-PCR获得了1株G9型A组轮状病毒VP7蛋白的cDNA片段,对其进行扩增、克隆、测序,用DNASTAR生物软件对其进行序列分析,同时采用参比毒株分组的方法进行序列比对.结果 该G9型哈尔滨地方株VP7基因为1 061个碱基,推导326个氨基酸；与中国北京株BJ-CR531进行氨基酸序列比对,一处变异位点在aa221[丝氨酸(Ser)→甘氨酸(Gly)],发生在C区；在分组比对中,哈尔滨G9型毒株所在组的标志性位点在aa8和aa65,均是由丙氨酸(Ala)替代苏氨酸(Thr).结论 哈尔滨G9型毒株所在组的aa8和aa65位点可能成为中国地区A组轮状病毒G9型这一进化分支的关键变异位点.
