乙型肝炎病毒聚合酶基因B区和C区序列的异质性

乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因编码约816个氨基酸的多蛋白,其氨基端为末端蛋白,羧基端为RNA酶H,后者上游紧邻反转录酶/DNA聚合酶.通过计算机模拟分析将HBV聚合酶基因分为假想的A到E共5个区段.

诺如病毒聚合酶基因的扩增及其遗传变异研究

目的 检测该病原,并溯源. 方法 通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、测序获得聚合酶基因序列,分子生物学分析软件及互联网数据库进行遗传变异研究. 结果 该病原为GⅡ-4亚型诺如病毒,其聚合酶基因非常保守,与同期日本爆发的诺如病毒毒株序列相似性达99％,可能来源于日本. 结论 诺如病毒感染引起的急性胃肠炎是影响全世界成人和儿童健康的重要因素,该病毒可以在贝类中富集,因此严格监测国内疫情、检测水产品进出境以避免该病的跨国传播.

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的耐药性研究

拉米夫定(Lamivudine,简称3TC)是具有强大抑制病毒作用的新一代核苷类药物.我国药品监督管理局及美国FDA在1998年底批准该药用于治疗慢性乙型肝炎(CHB).经国内外5年多临床研究,治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染者5000多例,发表论文近200篇,结果证明:拉米夫定在细胞内磷酸化为三磷酸拉米夫定后发挥其抑制逆转录酶,阻断病毒DNA合成与复制作用.临床治疗CHB患者,可降低体内HBV病毒水平,降低ALT水平和胆红素水平,恢复肝功能;亦可明显改善肝组织学,包括已形成的肝纤维化、肝硬化;延缓肝纤维化与肝硬化的进程[1].但引起人们关注的是拉米夫定治疗9～10个月后,开始出现对拉米夫定耐药的HBV株,这些HBV株的聚合酶基因发生变异,多为YMDD株,导致疗效下降,不少人据此对拉米夫定的效果产生疑问.因此,对拉米夫定耐药现象及耐药机制的研究又成为另一热点.本文就研究的现状进行综述.

RNA干扰抗A型H1N1流感病毒的研究

目的 制备靶向A型H1N1流感病毒RNA聚合酶(PA)基因的小干扰RNA(siRNA),研究其抑制病毒复制的效果.方法 设计并合成3对靶向A型H1N1流感病毒PA基因的siRNA,构建表达质粒pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537,分别转染MDCK细胞及鸡胚,并感染H1N1亚流感病毒,检测siRNA抑制流感病毒复制的效果.结果 设计的3对siRNA中,pS-PA1537可明显抑制A型H1N1流感病毒在MDCK细胞及鸡胚中的复制.结论 该研究为开发抗H1N1治疗制剂研究奠定了基础.

046 1918流感病毒聚合酶基因的特征

单碱基延伸法检测乙型肝炎病毒YMDD基序变异

目的 建立一种简便、快速检测乙型肝炎病毒(HBV)P基因区色氨酰-蛋氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰(YMDD)基序变异混合株组成的检测方法.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增含有YMDD基序的聚合酶(P)基因区片段,将PCR产物捕获至链亲合素包被的微孔板,以探针与PCR产物杂交,该探针3'末端位于待检测变异点上游一位碱基;在4个独立的微孔中分别加入4种荧光素标记的双脱氧核苷酸(Fluorescien-12-ddNTP)及Klenow酶进行单碱基延伸反应;酶标抗荧光素抗体结合Fluorescien-12-ddNTP,加底物显色,测定各孔吸光度,根据公式计算野生株及变异株在混合毒株中所占百分比.结果 以野生株和变异株单克隆质粒不同比例混合的标准品,验证本方法可检测混合株中含量少至10%的毒株,模板的适宜浓度范围为100 fg/ml～1 ng/ml.结论 单碱基延伸法是一种简便、快速、灵敏度和特异性较高的点突变检测方法,且可以检测混合株中各成分所占百分比.

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律.方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918～2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918～2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列.结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近.三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性.2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1(DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1(1918～2008年)病毒的赖氯酸不同.结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源干2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程.

乙型肝炎病毒对拉米夫定耐药性研究近况

目前全国约有1.3亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者,慢性乙型肝炎(CHB)约2300万.每年我国在病毒性肝炎的直接治疗费用约500亿元,病毒性肝炎是"国害".CHB仍将是严重影响我国人民健康的重要疾病[1].近年来,拉米夫定(Lamivudime)已被证实具有显著的抑制HBV复制作用,从而为抗HBV治疗开辟一条新途径.经国内外6年多临床研究,治疗HBV感染者6000多例,发表论文200多篇.结果证明:拉米夫定抗HBV作用机制是药物在宿主细胞内经磷酸化后成为5'-三磷酸酯衍生物,竞争性抑制HBV-DNA活性;与dCTP竞争掺入到复制中的DNA链中,使DNA合成终止而发挥抗病毒作用.大规模临床实验表明,拉米夫定具有显著抗HBV作用,并伴有血清学、组织学的改善.但长期的抗病毒效果仍需继续观察[2].但引起人们关注的是拉米夫定治疗6～10个月后,开始出现对拉米夫定耐药的HBV株,这些HBV的聚合酶基因发生变异,多为YMDD株,导致疗效下降,不少人据此对拉米夫定的效果产生疑问.因此,对拉米夫定耐药及耐药机制研究又成为另一热点.现就研究近况综述如下.

猪源冠状病毒聚合酶基因的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株序列对TGEV TS株聚合酶基因(ORF1)设计特异性引物,经RT-PCR扩增获得了20054bp的片段,与预期大小相符.TS株与Pur46-MAD株的ORF1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%和99.0%,与FIPV、PEDV、HCV299E及SARS氨基酸同源性分别为88%、57%、57%和45%.不同冠状病毒比较结果显示RdRp有很高的保守性而且有重要的作用,序列分析标明TS株在ORF1a和ORF1b重叠区有核糖体剪切位点UUUAAAC,且相应区域RNA二级结构形成3个茎环结构.

乙型肝炎病毒基因型与聚合酶基因异质性

目的对202株乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因(P基因)序列进行系统分析,研究HBV基因型间P基因差异,为进一步研究HBV基因型、P基因变异与病毒复制及核苷类似物耐药的关系提供参考. 方法采用计算机软件对GenBank中已发表的202株HBV全序列及P基因进行分析比较. 结果 HBV P基因在各基因型具有自身特点:在反转录酶(rt)区,A基因型氨基酸的型内差异较小,C、D基因型氨基酸的型内差异较大;在rt区A～F 6个高度保守区域,发现在基因型间及型内存在氨基酸水平的差异. 结论 (1)P基因及其氨基酸存在基因型间和型内异质性,因而分析某些氨基酸差异是与耐药有关还是准株被选择的结果,应综合考虑在该位点是否存在基因型间或型内的氨基酸差异;(2)对核苷类似物抗病毒治疗应答以及治疗中耐药现象的发生在HBV不同基因型可能不同.

乙型肝炎病毒聚合酶基因变异检测及临床应用

目的检测乙型肝炎病毒聚合酶基因变异并探讨其与拉米夫定疗效的关系.方法对38例拉米夫定治疗(100 mg/d)48 w后血清HBV DNA阳性患者,采用聚合酶链反应(PCR)产物直接测序技术,检测其血清中HBV DNA P基因序列,并推导为相对应的氨基酸序列,同时和Genbank中标准株序列相比较.结果G473→R和D477→N变异14例,M550→I变异12例,M550→V变异8例,L526→M变异10例,M550→V变异均伴有L526→M变异2例,M550→I变异伴有L526→M变异,未曾发现L526→M单独变异株,另外发现N(D)480→E 2例,N(D)480→S 2例,R485→H 1例,S505→T 2例,L510→M 1例,V537→I 1例,有11例HBV DNA阳性标本未检出变异.结论乙型肝炎病毒P基因区YMDD变异和L526→M变异是影响拉米夫定疗效的主要因素,G473→R和D477→N联合变异可能是影响拉米夫定疗效的又一重要原因,P基因变异的检测有助于临床疗效观察.