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杆状病毒经口感染因子之间相互作用分析
昆虫杆状病毒包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV)被幼虫食下后通过感染中肠上皮细胞引发全身感染,这个过程被称为经口感染.多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,它们被称为经口感染因子(PIFs).研究表明7种PIFs:P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF6、P95 (Ac83)和2种ODV特异性蛋白,Ac5和Ac108,与ODV表面复合物相关,该复合物被称为PIF复合物.阐明杆状病毒PIFs之间,尤其是复合物各个成分之间的相互作用特点是了解经口感染因子功能的关键.本研究以杆状病毒模式种-苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)为研究对象,利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术探究了与PIF复合物相关的9种蛋白之间相互作用的特点.我们鉴定到了6对相互作用,分别为PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4,但是没有鉴定到P74、PIF6、Ac5和Ac108参与相互作用.其中PIF1-PIF3、PIF2-PIF3和PIF1-P95为强相互作用,其他相互作用为中等强度相互作用.根据这些结果我们推测PIF1是PIF复合物的中心,其他成分都和PIF1存在相互作用.后,我们对目前为止已报道的PIF之间相互作用进行了总结,包括10对不同蛋白之间的相互作用:PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3、PIF3-PIF4、ODV-E56-PIF1、ODV-E56-PIF2、ODV-E56-PIF3和ODV-E56-P74,以及2对自相互作用:PIF3-PIF3和ODV-E56-ODV-E56.总之,本研究探索了PIF复合物中蛋白质的相互作用特点,揭示了复合物中各成分如何通过相互作用有机地结合在一起,推进了对该复合物的认识.
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运用BiFC技术检测LOX-1与AT1受体的相互作用
目的 运用双分子荧光互朴(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)介导血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1 (LOX-1)和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)之间的相互作用,推测其可能是参加动脉粥样硬化等心血管疾病过程的重要机制之一.方法 将LOX-1与AT1受体质粒共转染COS7细胞,给予ox-LDL(50ug/ml)刺激后,检测细胞中p-ERK表达水平.根据BiFC载体和AT1,LOX-1基因序列设计引物,将AT1、LOX-1基因克隆到BiFC特异性的荧光载体上,得到重组BiFC质粒:phmKGN-MN-AT1,phmKGC-MN-AT和phmKGC-MC-LOX-1,phmKGN-MC-LOX-1,配对共转染HEK293细胞,用ox-LDL(50μg/ml)刺激,研究AT1受体和LOX-1的相互作用;构建G蛋白偶联受体家族中另一蛋白肾上腺素受体β2(β2-adrenergic receptor,β2AR)的BiFC重组质粒:phmKGN-MN-β2AR和phmKGC-MN-β2AR,分别与LOX-1对应的BiFC质粒转染HEK293细胞,ox-LDL(50ug/ml)刺激后,观察细胞荧光.结果 用ox-LDL刺激转染AT1与LOX-1受体质粒的COS7细胞,可以引起p-ERK表达升高；成功构建AT1、LOX-1、β2AR的BiFC重组质粒;将AT1和LOX-1的BiFC质粒共转染HEK293细胞,用ox-LDL刺激后,可以观察到绿色荧光.而转染β2AR和LOX-1的BiFC质粒,用ox-LDL刺激后未检测到荧光.结论 初步验证ox-LDL可以诱导LOX-1与AT1受体特异性相互作用.
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双分子荧光互补技术在神经系统变性疾病蛋白质寡聚化研究中的应用
神经系统变性疾病(ND)的病理特征是蛋白质聚集在细胞内或细胞外形成异常的堆积体而导致神经毒性.双分子荧光互补技术(BiFC)是研究ND相关蛋白质寡聚化分子机制的重要工具.与其他技术不同的是,BiFC不但可以在生理环境中对蛋白质-蛋白质之间的相互作用进行可视化检测,而且能够提供详细的亚细胞定位信息.本文通过综述BiFC技术的原理、优缺点及其在ND研究领域中的应用进展,探讨该技术对揭示寡聚体和包涵体形成原因方面的潜力,为神经系统疾病开发新的治疗策略提供重要参考.
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HIV-1衣壳蛋白抑制剂体外筛选方法研究进展
HIV-1的感染高度依赖其圆锥形的"富勒烯"型衣壳.衣壳由大约1500个衣壳蛋白组装而成.近年来,衣壳蛋白已成为设计和筛选抗HIV-1药物的理想靶点.目前,文献已报道了多种基于不同原理的HIV-1衣壳蛋白抑制剂的筛选方法,该文将对这些体外筛选方法进行综述.
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双分子荧光互补在蛋白质相互作用中的应用
生物体是一个复杂的有机体,是物质运动的高级形式,这种运动方式是通过蛋白质来实现的.人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质.生命活动中各项功能和行为并不是由单一的蛋白质来完成的,蛋白质间的相互作用以及功能、构象变化参与和影响着生命的全过程,因此深入理解蛋白质相互作用,研究出蛋白质相互作用网络是揭示生命活动奥秘的前提.基于生物化学、微生物学、分子生物学、生物物理学和生物信息学的知识和技术,已经建立了多种研究蛋白质相互作用的方法.目前常用的研究蛋白质相互作用的方法有:GST沉降实验(GST-puN down)、串联亲和纯化、免疫共沉淀、酵母双杂交、化学交联、荧光能量共振转移和双分子荧光互补实验等.本文综述了双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)的起源、原理、发展以及在研究蛋白质相互作用中的应用.
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双分子荧光互补载体pBiFC-VN173-p12和pBiFC-VC173-Nbp的构建及鉴定
目的:应用双分子荧光互补技术,构建和鉴定真核表达载体pBiFC-VN173-p12,pBiFC-VC173-Nbp,为进一步研究p12 CDK2-AP1蛋白和Nbp蛋白在活细胞内的相互作用奠定实验基础.方法:以原核载体pGEX-4T-1-p12,pGEX-4T-1-Nbp为模板扩增出p12CDK2-AP1蛋白和Nbp蛋白的目的基因序列,分别定向克隆到Venus双分子荧光互补载体pBiFC-VN173和pBiFC-VC173上,重新构建成真核表达载体pBiFC-VN173-p12和pBiFC-VC173-Nbp,双酶切及测序鉴定.结果:重新构建的真核表达载体pBiFC-VN173-p12和pBiFC-VC173-Nbp经双酶切及测序结果均正确.结论:成功构建了真核表达载体pBiFC-VN173-p12和pBiFC-VC173-Nbp,为进一步观察p12CDK2-AP1蛋白和Nbp蛋白在活细胞内的相互作用提供了实验基础.
关键词： 双分子荧光互补 蛋白质相互作用 p12CDK2-AP1
