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miR-144在SKOV-3细胞中的表达及对Beclin-1的调控作用
目的 检测雷帕霉素诱导细胞后4种miRNAs的表达情况,并进一步研究miR-144与Beclin-1基因的靶向调控作用.方法 对SKOV-3细胞分别进行雷帕霉素(50 μg/L,反应2h)及3-甲基腺嘌呤(10 nmol/L、反应12 h)处理,RT-qPCR检测各组细胞miR-17、miR-20a、miR-144及miR-155的表达;Western blot检测雷帕霉素组Beclin-1蛋白的表达;双荧光素酶报告系统、Westem blot及RT-qPCR,验证miR-144与Beclin-1之间的靶向调控关系.结果 与正常对照组相比,雷帕霉素组SKOV-3细胞的miR-17、miR-144及miR-155的表达水平显著上调(P＜0.05);3-MA组SKOV-3细胞的miR-17、miR-20a及miR-144的表达水平显著下调(P＜0.05);雷帕霉素组Beclin-l的蛋白表达明显低于正常细胞组(P＜0.05).miR-144可靶向作用Beclin-1的3'非翻译区(3'UTR),且抑制其表达;miR-144能明显抑制Beclin-1蛋白及mRNA的表达.结论 miR-144可靶向抑制Beclin-1基因的表达,并参与调控SKOV-3细胞自噬的过程.
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巨噬细胞内microRNA与结核分枝杆菌相互作用的研究进展
结核分枝杆菌(MTB)为结核病的病原菌,感染机体后主要寄生于巨噬细胞内.MiRNA是一类内源性非编码小分子RNA,在转录水平上负向调控基因的表达.miRNA在MTB感染机体后部分可稳定存在于巨噬细胞内,miR-125a,miR-144,miR-146a,miR-155等表现出明显的上调或下调的变化.本文就巨噬细胞内miRNA与MTB相互作用的研究进展作一综述.
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长链非编码MEG3靶向miR-144表达对结肠癌细胞增殖转移潜能影响
目的 母系表达基因3(maternal expression gene 3,MEG3)在多种恶性肿瘤中表达异常,本研究评估MEG3和miR-144在结肠癌细胞中的表达状态,并进一步探讨MEG3与miR-144的相互作用,研究其与下游相关通路对结肠癌增殖和转移过程中的作用及其机制.方法 收集2016-01-10-2017-01-10宁波市鄞州区第二医院手术切除并且经病理检查确诊为结肠癌组织80例,同时取配对癌旁正常结肠组织80例.人结肠癌细胞株HT-29、SW480、SW620及RKO细胞株购于上海细胞研究所.qPCR检测MEG3和miR-144在不同结肠癌细胞株中的表达情况以及MEG3在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达;分析MEG3和结肠癌患者的临床病理资料之间的关联;双荧光素酶报告基因检测MEG3与miR-144之间的相互作用;MTT增殖实验和Transwell侵袭实验检测抑制MEG3后结肠癌细胞的增殖和侵袭能力的变化情况,及抑制miR-144表达后对结肠癌细胞增殖和侵袭能力的恢复情况;蛋白质印迹法检测抑制MEG3后PTEN/AKT信号通路蛋白的表达情况.结果 与其他结肠癌细胞株相比,SW620细胞中MEG3表达低(0.52±0.08),t=9.968,P<0.001,miR-144的表达水平高(1.25±0.11),t=9.648,P<0.05;结肠癌组织中MEG3的表达水平相比癌旁正常组织明显降低;MEG3的表达水平与结肠癌的病理分期相关以及淋巴结转移情况有关,随着分期越高,MEG3在结肠癌组织中表达越高,淋巴结转移的患者中MEG3的表达也相对较高;双荧光素酶实验证实MEG3能与miR-144的3′UTR特异性结合,可以调控miR-144的表达与活性;抑制MEG3的表达后可以促进结肠癌细胞的增殖能力(3.52±0.59),t=3.289,P<0.05和侵袭能力(321.52±23.24),t=15.900,P<0.001,差异有统计学意义;同时抑制miR-144的表达水平过后,结肠癌细胞的增殖(3.63±0.48,t=4.303,P<0.05)和侵袭能力(89.52±8.19,t=15.327,P<0.001)得到一定程度的恢复;抑制MEG3的表达后,PTEN/AKT信号通路被相应的激活,PTEN(1.19±0.15)％,t=10.954,P<0.001;AKT(1.29±0.18)％,t=8.881,P<0.001.结论 MEG3可以调控miR-144的表达通过PTEN/AKT信号通路影响结肠癌细胞的增殖和侵袭能力,为临床结肠癌诊治分子靶标研究提供一定的理论支持.
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活动期肺结核外周血mir-144的表达水平及意义
目的 探讨活动期肺结核患者外周血mir-144表达水平及临床意义.方法 选择2014年1月～2015年1月在笔者医院就诊的20例活动期肺结核患者及20例健康体检者作为研究对象,收集其静脉血,分别提取两组患者外周血单个核细胞中总RNA,采用实时荧光定量PCR比较其外周血mir-144的表达水平情况,采用受试者工作特征曲线(receiver operating eharacteristic curve,ROC)评估mir-144的诊断效能.同时采用ELISA法测定两组研究对象血浆中的IL-6、TNF-α、IFN-γ的水平.进一步进行相关性分析评估外周血mir-144表达水平与IL-6、TNF-d、IFN-γ的相关性.结果 活动期肺结核患者外周血中mir-144表达水平相比较健康对照组高,差异有统计学意义(P＞0.05).活动期肺结核患者外周血中IL-6、TNF-α、IFN-γ的水平比健康对照组要高,差异有统计学意义(P＜0.05).ROC下面积为0.885,当佳筛查阳性界值(cut-off值)为0.955时,敏感度和特异性均为85％.活动期肺结核外周血中mir-144的表达水平与其血浆中的IL-6、TNF-α、IFN-γ的水平呈负相关,相关系数分别为-0.905、-0.910、-0.892.结论 外周血单个核细胞中mir-144的表达水平可能作为活动期肺结核诊断的一个血清学指标,mir-144在结核杆菌感染后免疫反应中可能与外周血IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达水平有关.
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纳米二氧化硅致大鼠肺损伤中miR-144的作用
目的 探索miR-144在纳米二氧化硅(SiO2)致大鼠肺损伤中的生物学作用.方法 150只健康雄性SD大鼠随机分生理盐水对照组和6.25、12.5、25.0 mg/ml纳米SiO2组及25.0 mg/ml微米SiO2组,每组30只,分别于染尘7、15、30、60、90 d后各处死6只,观察各时间点大鼠肺组织的病理改变.用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测大鼠经气管一次性灌注25 mg/ml纳米SiO290 d后肺组织中miR-144的表达水平;用Targetscan、microRNA.org及miRDB 3个数据库对miR-144进行靶基因预测;用the Gene Ontology、KEGG分别对预测靶基因进行功能显著性富集分析和信号通路分析,筛选与肺纤维化相关的靶基因.结果 25.0 mg/ml纳米SiO2染尘90 d组大鼠肺组织中miR-144表达上调,与Hiseq 2000高通量测序的结果一致;筛选miR-144的预测靶基因为SMAD4、SMAD5、ADAMTS3、ADAMTS15、ADAMTS19等,这些基因可能与纤维化相关或参与纤维化通路.结论 miR-144可能参与肺纤维化的调控,在纳米SiO2所致肺损伤中发挥一定作用.
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肺鳞癌中miR-144靶基因预测及其生物信息学分析
目的:分析miR-144靶基因在肺鳞癌中参与的信号通路生物过程.方法:分析TheCancerGenomeAtlas网站中肺鳞癌患者的miR-144的表达量及生存曲线;预测miR-144靶基因并通过表达数据筛选影响肺鳞癌进展基因;BinGo软件对候选靶基因进行GO注释分析,利用DAVID网站预测其信号通路.结果:miR-144表达量高有利于延长肺鳞癌患者生存时间.综合4个靶基因数据库发现miR-144有72个预测结果,其中45个在肺鳞癌患者癌与癌旁组织间表达存在差异.其中部分候选靶基因参与胞核及星形微管的组成,参与上皮细胞增生、RNA合成.通路分析显示部分候选靶基因参与Ras、Wnt、Hippo等信号通路.结论:45个miR-144候选靶基因通过多条信号通路及生物过程调节细胞生命活动,影响肿瘤患者生存预期.
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MiR-144对人脑胶质瘤干细胞的生物学行为的影响
目的 研究miR-144对人U87来源的胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)生物学行为的影响.方法 以干细培养液培养人U87胶质瘤细胞2周后,应用免疫荧光法检测细胞球的Nestin及CD133的表达,同时细胞球在含有10％胎牛血清培养基中分化培养2周,应用免疫荧光法检测GFAP和tubulinⅢ的表达.过表达或抑制miR-144的表达,应用CCK8法检测GSCs的细胞活力,应用FITC-PI双染色方法检测细胞凋亡,应用Transwell小室方法检测细胞迁移及侵袭能力.结果 细胞球表达Nestin及CD133.细胞球分化培养2周后,细胞表达GFAP及tubulinⅢ.与non-GSCs相比,在GSCs中miR-144的表达明显降低.与阴性对照组相比,过表达miR-144显著抑制了GSCs的细胞活力和细胞迁移及侵袭能力,诱导了GSCs的凋亡.而抑制miR-144的表达显著提高了GSCs的细胞活力和细胞迁移及侵袭能力,抑制了GSCs的凋亡.结论 MiR-144能够显著抑制人U87来源的GSCs的细胞活力及细胞迁移及侵袭能力,诱导GSCs的凋亡.
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miR-144CCNB1信号调节通路在肝癌增殖、迁移和侵袭作用及相关机制的研究
目的 探讨microRNA-144细胞周期蛋白B1(miR-144CCNB1)信号调节通路在肝癌增殖、迁移和侵袭作用及其相关机制.方法 以2011年1月～2016年1月我院收治的100例肝癌患者的肝癌组织和癌旁组织为研究标本,采用荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测肝癌及其癌旁组织的miR-144表达和CCNB1蛋白表达情况,采用RNA干扰技术沉默CCNB1基因,并将靶向CCNB1的siRNA转染至肝癌细胞系HepG2和QGY-7703中,检测其对肝癌细胞生长、迁移和侵袭的生物学行为的影响.结果 肝癌组织中miR-144表达较癌旁组织明显下调,CCNB1蛋白在肝癌组织的表达水平较癌旁组织明显上调,miR-144高表达者预后无瘤生存期较其低表达者明显长,而CCNB1蛋白低表达者无瘤生存期明显长于其高表达者,差异有统计学意义(P＜0.05);与未处理者和阴性对照模拟物相较,转染CCNB1 siR肝癌细胞CCNB1蛋白表达水平明显下降;与未处理和阴性对照模拟物相较,转染CCBN1 siR HepG2细胞凋亡百分明显升高,转染CCNB1 siR HepG2细胞增殖能力明显下降,转染CCNB1 siR HepG2细胞迁移能力明显降低;与阴性对照模拟物和未处理细胞相较,转染CCNB1-siR QGY-7703细胞克隆团数(成瘤能力)明显减少.结论 miR-144CCNB1信号调节通路在肝癌增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,其可能机制为miR-144负向调控CCNB1表达,从而影响肝癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为,为肝癌治疗的新靶点提供理论依据.
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miRNA-144对肝癌侵袭性的影响
目的：探讨miRNA-144对肝癌细胞侵袭性的影响。方法从广东省人民医院肝癌标本库中选取52例肝癌组织标本及其对应的癌旁组织，用原位杂交技术检测miRNA-144在肝癌及相应的癌旁组织的表达情况，分析其与临床病理特征的关系，并行在线靶基因软件预测到miR-144的靶基因中有SRF。结果 miR-144在肝癌组织中相对癌旁组织高表达，并且 miR-144在肝癌组织中表达量仅与肝癌病理分级和术后早期复发有关，三大在线靶基因软件预测到 miR-144的靶基因中都有SRF。结论筛选得到的肝癌早期复发的 miRNA 差异表达谱可能与肝癌的病理分级和早期复发有关。
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miR-144负性调节大鼠巨噬细胞TOLL样受体2的表达
目的：明确TOLL样受体2（TLR2）与microRNA144（miR-144）作用之间的关系。方法利用不同浓度的miR-144的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）瞬时转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞，RT-qPCR检测miR-144和TLR2及其下游分子TNF-α的表达。利用大鼠肝脏cDNA为模板，PCR获取目的片段（即含miR-144野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3'UTR区）；用SacⅠ、XbaⅠ双酶切pmirGLO报告基因载体和含miR-144野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3'UTR区，构建携带上述片段的双荧光素酶报告基因，并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒，即pmir-TLR2-3'UTR及pmir-mutant-TLR2-3'UTR；并用miR-144的mimics与双荧光素酶报告基因共转染明确miR-144与TLR2 mRNA的3'UTR区的靶向关系。结果瞬时转染100 nmol/L miR-144 mimics后，NR8383细胞中miR-144表达显著升高，而TLR2及其下游分子TNF-α表达显著下降；而100 nmol/L miR-144 inhibitor作用则相反。PCR和双酶切DNA测序结果证实pmir-TLR2-3'UTR及pmir-mutant-TLR2-3'UTR重组载体构建成功；用100 nmol/L miR-144 mimics与空载体及上述两个构建体分别共转染HEK 293T细胞后，pmir-TLR2-3'UTR转染组相对荧光素酶活性显著降低。结论 miR-144通过靶向结合TLR2 mRNA的3'UTR区负性调节TLR2及其下游促炎因子的表达。
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miR-144对肝癌细胞生物学功能的影响及其临床意义
目的 探讨miR-144在肝癌组织中的表达水平及其对肝癌细胞生物学功能的影响,并分析其临床意义.方法 通过qRT-PCR法检测肝癌及其癌旁组织中miR-144的表达,以瞬时转染建立人肝癌细胞过表达miR-144模型,采用CCK-8和细胞克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的增殖和细胞克隆形成能力,采用流式细胞术、Transwell法检测肝癌细胞的细胞周期和迁移能力,分析miR-144的表达水平对肝癌细胞生物学功能的影响及其与临床病理特征的关系.结果 miR-144在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P＜0.05);与未处理及阴性对照的肝癌细胞相比,过表达的miR-144均能有效抑制肝癌细胞的增殖、细胞克隆形成及迁移能力(P均＜0.05),并诱导细胞周期阻滞在S期(P＜0.05);miR-144高表达组的肝癌患者术后生存时间长于低表达组(P＜0.05),miR-144的表达与患者性别、年龄、乙肝病毒感染、肿瘤大小、肿瘤个数、AFP、临床分期等临床病理特征无明显相关(P均＞0.05).结论 miR-144在肝癌组织中低表达且与预后相关,过表达的miR-144能够抑制肝癌细胞的增殖和迁移.
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重型β地贫患儿外周血miR-144基因的检测及意义
目的 检测重型B地贫患儿外周血miR-144基因表达水平,并分析miR-144与珠蛋白比率变化的关系.方法 运用RT-PCR分别检测各20例重型β地贫惠儿与健康对照组外周血miR-144基因表达水平及a/β珠蛋白的比率变化.结果 与健康对照组比较,重型β地贫患儿外周血miR-144表达水平下降,差别有统计学意义,并且与a/β珠蛋白基因比率变化呈负相关性.结论 微小RNA miR-144可能调控重型β地贫患儿a/β珠蛋白基因比率的变化,将为重型β地贫的基因调节治疗提供新的实验依据.
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miR-144通过靶向Atg4a调控卡介苗和雷帕霉素诱导的RAW264.7细胞自噬
目的 研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞自噬途径的作用机制.方法 分别对RAW264.7巨噬细胞进行饥饿处理12 h、50 ng/mL雷帕霉素作用2h、10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h;BCG刺激RAW264.7巨噬细胞12 h、24h、48 h后,收集细胞,提取总RNA;利用实时定量PCR (qRT-PCR)检测miR-21、miR-181a、miR-155及miR-144的表达水平;构建pMIR-Report-Atg4a及pMIR-Report-Atg4a mut重组质粒,利用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR及Western blot法验证miR-144与Atg4a的靶向作用关系.结果 BCG刺激RAW264.7巨噬细胞后,可使miR-21、miR-155及miR-144表达上调,miR-181a表达下调;经雷帕霉素诱导的细胞自噬,4种miRNA表达量与正常组相比分别上调约64倍、52倍、14倍、1倍;与正常组相比,3-MA处理细胞组,miR-21、miR-144、miR-155、miR-181a的表达量分别下调1.22倍、1.05倍、1.54倍及12.5倍;双萤光素酶报告系统及Western blot法证实,miR-144可靶向作用于Atg4a-3' UTR并抑制其表达.结论 miR-144可靶向抑制自噬相关基因Atg4a的表达,参与调控RAW264.7巨噬细胞的自噬过程.
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miRNA-144抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达
目的 构建miR-144真核表达载体,检测miR-144是否调控小鼠RAW264.7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达.方法 结合文献,通过预测软件分析,选取评分较高、可作用于ABCA1 mRNA 3 '非编码区(ABCA1 mRNA 3'UTR)的miR-144.通过分子克隆技术,利用PCR扩增miR-144和ABCAI mRNA 3'UTR的DNA序列,酶切胶回收后,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体和pcDNA3.1(+)-luciferase载体上.测序后,运用双荧光素酶报告基因系统检测萤火虫荧光素酶的活性,观察miR-144是否对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用.运用LipofectaminTM 2000将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1 (+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7巨噬细胞.通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染后miR-144的表达含量.通过qRT-PCR和Western blot法检测过表达miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的变化.结果 miR-144 PCR产物连接至pcDNA3.1(+)载体上,ABCA1 mRNA 3'UTR连接至pcDNA3.1(+)-luciferase载体上,测序正确.运用双荧光素酶报告基因系统检测发现,和对照组[pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3 ' UTR和PRL-SV40联合转染]三者相比,实验组[pcDNA3.1(+)-miR144、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者可以显著降低萤火虫荧光素酶的活性(P＜0.05),证明miR-144对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用.将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7细胞中,qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体组miR-144表达无明显变化(P＞0.05);转染pcDNA3.1(+)-miR-144组中miR-144表达量显著增高(P＜0.01).qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)-miR-144对ABCA1 mRNA表达水平无明显影响(P＞0.05),Western blot结果显示转染pcDNA3.1(+)-miR-144可以显著降低ABCA1蛋白水平的表达(P＜0.01).结论 miR-144可以在转录后水平降低ABCA1蛋白的表达.
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急性高原低氧对于大鼠心功能及其心肌组织miR-144表达影响的研究
目的 探讨急性高原低氧对于大鼠心功能及其心肌组织miR-144表达的影响.方法 应用低压氧舱模拟构建高原低氧大鼠模型.将6周龄雄性SD大鼠分为高原低氧3、7、14、28 d实验组以及常压常氧对照组,每组12只大鼠.超声心动图检测大鼠心脏结构和功能.qRT-PCR检测各组大鼠心肌组织miR-144表达.结果 超声心动图检查结果显示,高原低氧3 d和7 d组大鼠LVEF和FS均低于对照组.高原低氧14 d和28 d组大鼠LVEF和FS均高于对照组.高原低氧各组大鼠PV peak velocity和PV peak gradient数值均低于对照组.高原低氧各组大鼠左心室收缩末内径(LVIDS)和舒张末内径(LVIDD)均低于对照组.高原低氧3、7、28 d组大鼠心肌组织miR-144表达均高于对照组,高原低氧14 d组大鼠心肌组织中miR-144表达低于对照组.Spearman相关性分析提示,心肌组织miR-144表达丰度与左心室射血分数和短轴缩短率呈负相关.结论 急性高原低氧可导致大鼠左心室结构和功能发生变化,左心室内径缩小,室壁增厚,左心室舒张功能下降.高原低氧1周内左心室收缩功能下降,1周后左心室收缩功能恢复正常.急性高原低氧可导致大鼠心肌组织miR-144表达升高.miR-144表达与心功能变化呈负相关,推测miR-144可能参与调控高原低氧导致的心脏结构和功能变化.
