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胎猪胰腺干细胞扩增及诱导
目的 寻找胰腺干细胞扩增方法,为研究糖尿病的细胞治疗提供种子细胞.方法无菌采集胎猪胰腺,经胰酶消化,以含10%血清的RPMI1640培养基培养.细胞长满皿底85%时,用胰酶消化传代,传代5～6次后细胞活力下降,细胞大量死亡漂浮,留下少数贴壁的小圆细胞.将培养基中的血清浓度提高到15%,贴壁的小圆细胞能快速增殖并形成细胞克隆,4～6d便可融汇成单层.采用免疫组织化学方法对所获得的的细胞进行胰腺干细胞特征检测.结果经上述方法处理的细胞具有旺盛的增殖能力,可以连续传代,目前已传至64代.采用免疫组织化学检测细胞表达胰腺干细胞特征性标志物,胰肠同源域因子1(PDX-1)、葡萄糖转运子2(GLUT-2)、巢蛋白、波形蛋白;经诱导后细胞表达胰腺内分泌细胞的标志为胰高血糖素、胰岛素、生长抑索、胰多肽.结论通过该方法可以获得大规模扩增的胰腺干细胞,该细胞在体外诱导可分化形成胰腺内分泌部4种主要细胞.
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Conophylline联合Betacellulin-δ4对胎猪导管源胰腺干细胞体外诱导分化的促进作用
目的:研究Conophylline(CnP)联合Betacellulin-δ4(BTCδ4)对胎猪导管源胰腺干细胞的体外诱导分化作用.方法:在培养基中加入CnP、BTCδ4等诱导因子诱导胎猪导管源胰腺干细胞分化,台盼蓝检测CnP对胰岛样细胞团(islet-like cell cluster,ICC)的毒性,ICC行ELISA、免疫组织化学检测,逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测胰岛素基因、PDX-1等在未诱导、诱导细胞中的表达,葡萄糖刺激实验检测ICC分泌胰岛素的功能.结果:用0.1 g/L CnP诱导ICC不显示明显的细胞毒性.诱导培养4-6 wk,ELISA和免疫组织化学显示CnP联合BTCδ4提高了胰岛素分泌细胞量和胰岛素含量；RT-PCR显示提高了PDX-1,neuroD/Beta2,胰岛素等在ICC中的表达.葡萄糖刺激实验结果显示,诱导后,ICC合成、分泌胰岛素的能力显著增强（P＜0.05）.结论:CnP联合BTCδ4促进诱导胎猪导管源胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞,分化细胞表达p细胞表面标志并能分泌胰岛素.
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胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定
目的 建立胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定的方法.方法 采用胰酶和胶原酶Ⅳ、P消化法分离获得细胞,在含10％胎牛血清的M199培养基中行导管上皮细胞原代培养,而后将血清浓度提高到20％以上继续培养,3～4天后至每个小圆细胞形成一个集落;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)的方法对获得的细胞检测CK19、Pdx-1、NeuroD/Beta2、insulin、Glut-2等基因的表达.结果 成功分离获得胎猪胰腺导管细胞,并证实该细胞为胎猪导管源胰腺干细胞.经检测,细胞表达CK19,Pdx-1,Ght-2,NeuroD/Beta2等胰腺干细胞的标志,而insulin、Neurogenin3阴性表达.结论 该方法可较好地分离纯化出胎猪胰腺导管细胞,经鉴定获得细胞具有胰腺干细胞的特性.
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胎猪BMSC体外构建软骨的实验研究
目的比较胎猪骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）和成年猪BMSCs构建软骨能力的差异，寻找合适的同种异体组织工程软骨种子细胞来源。方法通过剖腹产手术获得胎龄为70 d的胎猪，胎猪骨髓液贴壁培养获得胎猪BMSCs；抽取成年猪骨髓液，经贴壁培养法获得成年猪BMSCs。两种细胞体外扩增培养后,观察第3代细胞形态，并进行成骨、成脂和成软骨诱导。分别取两种细胞以1×108 cells/mL的细胞终浓度，接种于聚乳酸包埋的聚羟基乙酸支架，体外诱导培养8周后取材。通过大体观察、糖胺聚糖（GAG）含量测定、总胶原含量测定、组织学，以及免疫组化等方法，对两种细胞构建的组织工程软骨的相关生物学特性进行比较。结果胎猪BMSCs比成年猪BMSCs具有更好的增殖和成骨、成脂和成软骨能力。胎猪BMSCs构建的软骨有良好的软骨外观，而且GAG含量和总胶原含量均高于成年猪BMSCs构建的软骨（P<0.01）。组织学和免疫组化显示，胎猪BMSCs构建的软骨组织结构致密，基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于成年猪BMSCs构建的软骨。结论胎猪BMSCs是组织工程软骨较好的种子细胞来源。
