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GATA-4在心肌基因表达调控中的作用及模式
GATA-4是心肌基因表达调控中的重要转录因子,通过与SRF和Nkx2.5等其他转录因子协同来调控心肌特异基因表达,决定心肌分化.GATA-4是多种刺激和信号通路的下游效应因子,被ERK1/2和p38激酶磷酸化,通过与AP-1和NF-AT3的协同作用,介导心肌肥大.
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心肌干细胞的定向分化和调控
在细胞因子、激素、药物、细胞间连接和细胞内转录因子等因素的诱导和调控作用下,CSC向心肌进行定向分化.如何正确筛选CSC应用于干细胞的移植治疗或对体内CSC向心肌的定向分化加以调控,对于临床合理利用CSC治疗心肌损伤性疾病将具有重要意义.明确CSC的生物学特性,探讨CSC向心肌的终末分化与调控机制,将为临床应用CSC治疗心肌梗死提供可靠依据.
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Foxa2调控P19胚胎癌细胞心肌分化过程的分子机制
目的:研究转录因子forkhead box A2(Foxa2)在P19胚胎癌细胞心肌分化过程中的作用及其分子机制.方法:运用在P19细胞胚胎小体(embryoid bodies,EBs)培养基中加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的方法将P19细胞诱导分化成心肌细胞,运用反转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测诱导分化过程中不同时间点细胞样本中胚胎性干细胞多能性相关基因(Nanog)、心肌分化相关基因[Cerberus1 (Cer1)和Sonic Hedgehog (Shh)]及Foxa2的mRNA水平,用免疫荧光染色的方法检测分化成熟的心肌细胞.同时分别运用转染真核表达质粒pCMV-rFoxa2(大鼠Foxa2)和构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)-rFoxa2 P19细胞株的方法以提高P19细胞中Foxa2的表达水平,采用RT-PCR和Western印迹的方法检测上述细胞样本中多能性相关基因和心肌分化相关基因的mRNA和蛋白水平,及其EBs分化体系中心肌分化相关基因的mRNA水平.结果:P19细胞经DMSO诱导后分化形成心肌细胞,并伴随有Foxa2的表达激活.转染pCMV-rFoxa2质粒能在P19细胞中瞬时高量表达rFoxa2并激活其下游Cer1的转录.运用稳定表达GFP-rFoxa2的P19细胞株增高Foxa2的表达可以抑制Nanog的表达,并激活Shh的表达,促进P19细胞EBs心肌分化,表达Cer1和心脏α肌动蛋白(actin,alpha cardiac muscle 1,Actc1).结论:Foxa2参与P19细胞心肌分化过程,Foxa2在DMSO诱导P19细胞心肌分化过程中的作用机制可能为直接抑制Nanog的表达,并激活Cer1和Shh的表达.
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干细胞心肌分化的表观遗传学机制
表观遗传学是一门新兴的遗传学分支,研究细胞核内DNA序列没有改变的情况下,基因功能的可逆的、可遗传的改变.表观遗传学调控机制涉及DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑和微小RNA调控等领域.有研究表明干细胞心肌分化过程中伴随着表观遗传学的改变,促进干细胞表观遗传修饰发生改变的药物可以诱导干细胞心肌分化,表现遗传学机制已成为目前研究干细胞心肌分化机制的热点,为干细胞在发育生物学、遗传学和再生医学等领域的应用提供了新的理论依据和手段.
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大鼠心肌细胞诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究
目的:研究人间充质干细胞(MSCs)向心肌方向分化的机制.方法:将人MSCs以10000/cm2的密度接种,共分为四组:1)对照组;2)共同培养组:人MSCs和新生SD大鼠心肌细胞进行共同培养;3)条件培养液组:将从新生SD大鼠心肌细胞培养中获得的培养液,用于人MSCs的培养;4)细胞匀浆液组:将心肌细胞匀浆液用于人MSCs的培养.分别于实验第2、5、7天收集各实验组的人MSCs,进行Desmin及肌钙蛋白Ⅰ的免疫组化染色.在共同培养组中,同时还用抗人DNA进行的荧光原位杂交,以区分鼠来源的细胞及人来源的细胞.结果:在对照组、条件培养液组及细胞匀浆液组均未检测到心肌特异性蛋白的表达.在共培养组中,第2天,部分人MSCs开始表达Desmin,第5天细胞开始表达cTnI,至第7天阳性表达率达35%左右.结论:与大鼠心肌细胞共同培养可以诱导人MSCs向心肌方向的分化,而心肌细胞的条件培养液及心肌细胞匀浆不能诱导它们的心肌分化.
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胎儿肝脏间充质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究
目的:研究来源于胎儿肝脏的间充质干细胞(FMSCs)移植到大鼠心肌梗死模型中的存活及分化情况.方法:从平均胎龄为9周的胎儿肝脏中分离培养出FMSCs,将该细胞移植到大鼠梗死心脏模型中,分别于移植后第7及第14天时取出心脏,通过荧光原位杂交及免疫组化的方法检测移植细胞的存活及心肌分化情况.结果:FMSCs具有稳定的抗原表达谱,阳性表达CD29、CD44、CD166、CD105、SH3、SH4,不表达造血干细胞表面标志抗原如CD14、CD34、CD45.荧光原位杂交显示,将细胞移植到大鼠心肌梗死模型中7天后,有较多细胞在心肌组织中存活;但至移植后第14天,移植细胞从心肌组织中消失.免疫组化染色未发现存活的植入细胞发生向心肌方向的分化.结论:本实验成功分离培养出了FMSCs,将其移植到梗死心肌模型中能短暂存活,但不发生向心肌方向的分化.
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5-氦胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的研究
目的 研究在单层培养条件下,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的可能性和效率.方法 实验分为实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.2组细胞均在单层培养条件下,以5-aga(1 μmol/L)诱导.倒置显微镜观察细胞的生长状态;诱导4、8、12、16 d,Western blot检测α-fiareomeric actin和cTnT的表达;并用免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达.结果 实验组和埘照组细胞在5-aza诱导下,生长缓慢,死亡细胞数目增多.随贴壁细胞密度增加,形成类似于聚集体贴壁生长的状态,中心细胞小、密集,周边细胞呈放射状排列,胞体长梭形,伸出突起.实验组诱导8、12、16 d检测到α-sarcomeric actin和cTnT 2种蛋白的表达和共表达,表达量呈增多趋势;诱导12、16 d时α-sarcomeric aetin的表达量与8 d比差异有统计学意义(P<0.01),诱导16 d的表达量与12 d比差异有统计学意义(P<0.01);cTnT在诱导12、16 d的表达量与8 d比差异有统计学意义(P<0.01).对照组没有2种蛋白的表达和共表达.结论 5-aza可诱导单层生长的表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化.
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Wnt3a在小鼠胚胎心肌分化中的作用
目的:探讨Wnt3a在小鼠胚胎心肌分化中的作用.方法:检测Wnt3a在小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化过程中的表达和作用.实验组以二甲基亚砜(DMSO)作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt3a的表达,对比分化率.结果:两组在分化第二、三、四天Wnt3a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为91.67%,对照组分化率为37.50%,两组差异有显著性.结论:Wnt3a能够促进小鼠胚胎心肌分化.
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脂肪组织来源基质细胞的心肌样细胞分化
脂肪组织来源基质细胞具有多向分化潜能、易获得性、易于分离培养和较强的再生能力等突出优点,已成为一种新的组织工程干细胞来源.现就脂肪组织来源基质细胞生物学特性、影响分化因素、向心肌样细胞分化及治疗缺血性心脏疾病等方面进行综述.
关键词： 脂肪组织来源基质细胞 心肌分化 缺血性心脏病 -
骨髓间充质干细胞亚群心肌分化基因的筛选
目的：利用基因芯片筛选小鼠骨髓间充质干细胞4个亚群的差异表达基因，寻找心肌分化特异性基因。方法将小鼠骨髓间充质干细胞通过 CD45和 CD31的磁珠分选，获得 SCA-1垣/ CD45原/ CD31原、SCA-1垣/ CD45原/ CD31垣、SCA-1垣/CD45垣/ CD31垣及 SCA-1垣/ CD45垣/ CD31原4群细胞。采用基因芯片技术完成 Agilent 小鼠全基因4*44K 芯片表达谱基因检测，分析差异表达基因。根据基因芯片中所检测的基因表达量在 SCA-1垣/ CD45垣/ CD31垣亚群中高，且为其他亚群表达量的两倍以上为原则，通过 RT-PCR 验证各亚群及未分选细胞中的差异基因的表达量。结果根据皮尔森关联算法计算4组细胞亚群之间的关联值位于0.979~0.995之间，通过 RT-PCR 检测发现，Rock2基因在 SCA-1垣 CD45原 CD31原亚群中表达高，而在 SCA-1垣 CD45垣 CD31垣亚群中表达很低，Itga4在未分选群中表达高；Cxadr 在 SCA-1垣 CD45原 CD31原亚群中表达高；Epor在 SCA-1垣 CD45原 CD31垣亚群中表达高；myl3在 SCA-1垣 CD45垣 CD31垣亚群中表达高。结论 Rock2、Cxadr、Itga4、Epor 和myl3基因在干细胞亚群向心肌分化中发挥不同作用。
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催产素诱导去分化脂肪细胞向心肌细胞方向分化
目的:检验催产素能否将去分化脂肪(DFAT)细胞诱导分化成为心肌样细胞.方法:从脂肪中分离成熟的脂肪细胞,通过天花板培养使成熟脂肪细胞去分化为DFAT细胞.按照不同诱导的时间(1周、2周、3周)及低中高3个不同浓度的(1×10-8 mol/L、1×10-7 mol/L、1×10-6 mol/L)分组对DFAT进行诱导培养.通过免疫荧光检测法、RT-PCR及Western blot分别在基因水平和蛋白水平上检测心肌特异性标记的表达,以人类心肌组织作为阳性对照,未加诱导的DFAT细胞作为阴性对照.结果:高浓度的催产素(1×10-6 mol/L)造成实验细胞大量死亡,无法进行后续试验.以1×l0-8 mol/L及1×10-7 mol/L浓度的催产素诱导3周后,DFAT细胞在基因及蛋白水平上检测到心脏特异性标记GATA4、Nkx2.5及cTnT的表达,但未发现自主搏动现象.结论:生理浓度和中等浓度的催产素,可以将DFAT细胞诱导成为心肌样细胞.
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5-氮胞苷诱导单层P19细胞向心肌分化
目的:研究Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层P19细胞向心肌分化中的作用.方法:实验分实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.两组细胞均单层培养,以5-aza(1 pxnol/L)诱导,倒置显微镜观察细胞的生长状态;5-aza诱导的4,8,12,16 d,免疫细胞化学检测横纹肌α-actin(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取5-aza诱导16 d的细胞透射电镜观察超微结构的变化.结果:实验组5-aza诱导的8,12,16 d检测到α-SA和cTnT的阳性表达,表达量逐渐增多.对照组没有两种抗体的阳性表达;实验组5-aza诱导16 d,电镜观察发现部分相邻细胞分化出细胞连接和心肌发育早期的闰盘结构,胞质中出现密集平行排列肌丝样结构.对照组没有发现分化的细胞.结论:外源表达Nkx2-5基因促进P19细胞单层生长时向心肌分化.
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miR-20b过表达对P19细胞增殖和细胞分化的影响
目的 探讨miR-20b过表达对P19细胞增殖和细胞分化的影响.方法 将包含鼠miR-20b成熟序列的慢病毒载体及空载体分别感染P19细胞,通过嘌呤霉素筛选2周,建立稳定过表达鼠mR-20b的P19细胞系.用Real-time PCR的方法验证稳定细胞表达株.用CCK-8方法检测稳定感染miR-20b过表达慢病毒和空载体的P19细胞间细胞增殖的差别.将稳定感染的两组细胞以无血清培养液37℃孵育24小时使细胞停留于GO期,而后恢复血清培养,取不同时间点的细胞,使用流式细胞仪检测两组间细胞周期的差别,从而间接验证CCK-8的结果.以1％二甲基亚砜(DMSO)将两组稳定感染的P19细胞诱导分化为心肌细胞,Real-time PCR检测心肌分化相关标志基因的表达,并用光镜观察分化过程中的形态变化.结果 建立了稳定表达miR-20b的P19细胞系,与空载体组相比,miR-20b过表达可抑制P19细胞的增殖,促进心肌分化相关标志基因的表达(P ＜0.05,P＜0.01或P＜0.001).结论 miR-20b过表达可显著抑制P19细胞的增殖,并具有促进P19细胞向心肌细胞分化的作用.
