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  • 丁酸钠和5-aza诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

    作者:董亮;连锋;杨文钢;汪永义;薛松

    目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(sodium butyrate)和DNA甲基化抑制剂5-aza对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌细胞分化的影响.方法 常规培养大鼠BMSCs,细胞分为4组:依次加入丁酸钠0mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM.MTT和流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠对细胞增殖和凋亡的影响.4周后利用western blot和免疫荧光检测4组细胞的心肌细胞特异性蛋白的表达.从上述4组中选出诱导能力强的丁酸钠组与5-aza组成4个实验组:阴性对照组,5-aza组,丁酸钠组,5-aza+丁酸钠组.作用4周后检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果 丁酸钠抑制细胞增殖,具有浓度依赖性,而对细胞凋亡没有明显影响.检测发现丁酸钠和5-aza均能有效诱导BMSCs分化为心肌细胞,丁酸钠诱导分化适浓度为1.0mM.同时1.0mM丁酸钠诱导分化效率高于5-aza.除此,5-aza和丁酸钠共同作用于BMSCs,其诱导分化能力明显高于其它组.结论 丁酸钠能够有效诱导BMSCs向心肌细胞分化,丁酸钠浓度为1.0mM时诱导能力强,同时诱导分化率高于5-aza.5-aza和丁酸钠一起作用诱导BMSCs向心肌细胞分化的能力明显高于其它组,间接证明DNA去甲基化和组蛋白乙酰化具有协同作用.丁酸钠在有效作用浓度范围内,虽然抑制BMSCs增殖,但是不影响细胞凋亡,表明丁酸钠具有低毒的特性,为以后丁酸钠应用于临床打下实验基础.

  • 全反式维甲酸诱导经典型霍奇金淋巴瘤B细胞表型

    作者:杜静;宫凯凯;杨丽娟;陈微微;罗丽卿

    目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对经典型霍奇金淋巴瘤B细胞表型的诱导作用.方法 构建含有G418抗性的B细胞特异性启动子(CD19,CD79a和CD79b)表达载体,转染霍奇金淋巴瘤细胞并筛选稳定克隆.PCR扩增启动子和荧光素酶序列验证其稳定整合,敲除ABF1后检测外源B细胞启动子活性的改变以验证其功能.检测不同浓度的ATRA在不同时间点对外源B细胞启动子活性的诱导作用,通过实时定量PCR进一步证实ATRA对B细胞特异性基因转录水平的影响;检测ATRA与去甲基化药物5-Aza联合处理对B细胞标记物表达的影响;通过流式细胞染色技术仪检测ATRA对霍奇金淋巴瘤细胞表面标记物CD30表达的影响.结果 ATRA能够诱导人经典型霍奇金淋巴瘤B细胞特异性标记物CD19、CD20、CD79a和CD79b的表达,与5-Aza具有协同诱导作用,并下调细胞表面霍奇金特异性抗原CD30的表达.结论 ATRA能够诱导B细胞表型缺失的经典型霍奇金淋巴瘤向B细胞型淋巴瘤转化.

  • 骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的困惑与争议

    作者:瞿海龙;彭广军;麻晓静;张冰;曹国辉

    1999年Makino等[1]首次在体外应用5-氮胞杂苷(5-Aza)将骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)定向分化成心肌细胞,为MSCs移植治疗心肌梗死提供了细胞生物学基础.2001年,Orlic等[2]将Lin-C-Kit+干细胞注射到心肌梗死小鼠的存活心肌内,发现其分化为心肌样细胞,开创了干细胞在体内移植治疗心肌梗死的先河.

  • p53基因在5-aza诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化中表达的研究

    作者:刘端阳;董钦;李凤兰;马宁;李晖

    目的 检测p53基因及其蛋白在5-aza诱导C3H10T1/2向心肌样细胞分化过程中的变化,进而探讨p53基因及其蛋白在胚胎早期心肌分化过程中发挥作用的条件.方法 以10 μmol/L的5-aza诱导C3H10T1/2向心肌样细胞分化,分别选取诱导后1周、2周、3周、4周这4个时间点进行样品收集.Tr-izol法提取诱导后细胞的总RNA,应用RT-PCR方法检测p53基因、肌钙蛋白I的表达情况;应用免疫细胞化学方法检测P53蛋白和心肌肌球蛋白重链的表达情况.结果 在mRNA水平,p53在诱导后1周和诱导后3周表达量较诱导后2周、4周要高;在蛋白水平,随着诱导时间的延长,蛋白表达量没有降低,而是维持在一定的水平甚至有所增加.结论 在5-aza诱导C3H10T1/2向心肌样细胞分化过程中,P53蛋白维持一定水平的表达是5-aza发挥其作用的先决条件.

  • Oct-4表达下调促大鼠骨髓多能成体祖细胞向心肌分化

    作者:谢靖芸;吕铁伟;朱静;陈国珍;孙慧超;刘振国;田杰

    目的:明确骨髓多能成体祖细胞(Bonemarrowmultipotent adult progenitor cells,MAPCs)体外向心肌特异性分化及其与八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscriptionfactor-4,Oct-4)表达的相关性.方法:将大鼠骨髓中分离出的MAPCs,在无血清培养基中连续培养35 d,采用5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza,l μmol/L)诱导24 h促使其向心肌细胞分化.结果:MAPCs在5-aza诱导的24 h后早期心脏特异性基因NKx2.5与GATA-4的mRNA水平显著增加,Western blot和免疫荧光染色显示心肌特异性蛋白Connexin-43与肌钙蛋白I在5-aza诱导后的7 d开始表达,流式细胞分析表明在35 d后超过37%的细胞为肌钙蛋白I阳性;同时实时定量聚合酶链反应、Western blot、免疫荧光染色和流式细胞技术检测到未分化的MAPCs高表达特异性干细胞标志物Oct-4,但在心肌分化过程中其表达明显下降.结论:MAPCs在5-aza诱导后能够有效地分化为心肌样细胞,并与Oct-4的表达下调相关.

  • 5-氦胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的研究

    作者:张金平;赵静;王慧娟;赵秀军;赵春芳;张雷

    目的 研究在单层培养条件下,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的可能性和效率.方法 实验分为实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.2组细胞均在单层培养条件下,以5-aga(1 μmol/L)诱导.倒置显微镜观察细胞的生长状态;诱导4、8、12、16 d,Western blot检测α-fiareomeric actin和cTnT的表达;并用免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达.结果 实验组和埘照组细胞在5-aza诱导下,生长缓慢,死亡细胞数目增多.随贴壁细胞密度增加,形成类似于聚集体贴壁生长的状态,中心细胞小、密集,周边细胞呈放射状排列,胞体长梭形,伸出突起.实验组诱导8、12、16 d检测到α-sarcomeric actin和cTnT 2种蛋白的表达和共表达,表达量呈增多趋势;诱导12、16 d时α-sarcomeric aetin的表达量与8 d比差异有统计学意义(P<0.01),诱导16 d的表达量与12 d比差异有统计学意义(P<0.01);cTnT在诱导12、16 d的表达量与8 d比差异有统计学意义(P<0.01).对照组没有2种蛋白的表达和共表达.结论 5-aza可诱导单层生长的表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化.

  • 5-氮杂胞苷通过p53/Gadd45α信号途径影响小鼠神经干细胞的增殖

    作者:刘娜;王虹;包金风

    目的:通过研究DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)对小鼠神经干细胞(neural stemcells,NSCs)的影响,进一步阐明DNA甲基化模式的变化对神经发生的影响及机制.方法:采用无血清悬浮培养方法分离培养新生小鼠脑NSCs,通过MTT法检测5-Aza对NSCs增殖的影响;应用流式细胞仪检测5-Aza对NSCs细胞周期和凋亡的影响;并用RT-PCR、Western Blot法检测给予5-Aza对NSCs细胞p53和Gadd45α mRNA水平和蛋白表达的影响.结果:MTT法测定结果显示:与对照组相比,5-Aza能够明显抑制NSCs的增殖;流式细胞仪测定结果显示,5-Aza组NSCs在G0/G1期细胞数量较对照组明显减少(P<0.01),而S期、G2/M期细胞数量则明显增多(P<0.01),表明5-Aza可引起细胞周期在G2/M期停滞;且5-Aza组NSCs的凋亡率与对照组相比明显增加(P<0.01).RT-PCR结果显示:5-Aza组NSCs中p53和Gadd45α mRNA水平较对照组明显增高(P<0.05);Westem Blot结果也显示:与对照组相比,5-Aza组NSCs中P53和Gadd45α蛋白表达量明显增加(P<0.05).结论:5-Aza可能通过影响NSCs细胞周期和诱导凋亡抑制小鼠NSCs增殖;5-Aza阻滞NSCs细胞周期的作用机制可能与p53/Gadd45α信号途径相关.

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