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实时荧光PCR实验过程污染的监测与防范
实时荧光PCR技术是一种实时监测PCR扩增产物,通过CT值和标准曲线的关系对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法.其优点是扩增量大、特异性强、灵敏度高、精确定量,但易污染,一直是困扰各实验室的大问题,极微量的污染就可能造成假阳性反应,导致实验结果失败.为了保证实验过程稳定、结果可靠,验证整个操作流程中是否存在污染的可能,必须进行污染的监测.通过有效地监测,采取正确的应对措施,防止或消除污染.
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实时荧光PCR技术应用于手足口病病原学检查的体会
目的 分析实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术在手足口病病原学检查中的应用价值.方法 选取2013年1月-2014年1月经临床确诊为手足口病的患儿125例,采集其临床标本共167份并均应用FQ-PCR技术行病原学检查,其中123份咽拭子标本同时采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检查.结果 167份临床标本的肠道病毒检出率为74.85％ (125/167),不同标本类型的EV71、CoxA16与混合感染阳性检出率组间比较,无统计学意义(P＞0.05);重症病例的EV71阳性率58.82％与总阳性率76.47％高于普通病例的16.67％与56.48％,CoxA16阳性率11.76％低于普通病例的39.81％,有统计学意义(P＜0.01);咽拭子标本应用FQ-PCR检查的EV71、CoxA16阳性检出率69.11％、46.34％均比RT-PCR检查的52.03％、31.71％高,有统计学意义(P＜0.05).结论 手足口病的主要病原体是EV71、CoxA16,FQ-PCR技术的病原菌检出率与标本采集方式无相关性,但可相应提高咽拭子标本病原的确诊率,改善临床治疗与预后效果.
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衡阳地区春夏季婴幼儿上呼吸道感染性疾病病毒谱分析
目的：了解衡阳地区春夏两季婴幼儿上呼吸道病毒感染的流行状况。方法收集2013年2~8月门诊和住院患儿咽拭子855例，其中春季（2~5月）468例，夏季（6~8月）387例；分别采用荧光抗体检测副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3，流感病毒A、流感病毒B、呼吸道合胞病毒、腺病毒，采用实时荧光PCR定量（RT-PCR）检测EB病毒。结果病毒检出率35.8%（306/855），副流感病毒1春季1.3%（6/468），夏季6.7%（26/387），差异有显著性（χ2=17.4，P<0.01）；副流感病毒2春季0.65%（3/468），夏季2.2%（9/387），差异无显著性（χ2=4.3，P>0.05）；副流感病毒3春季1.3%（6/468），夏季4.6%（18/387），差异有统计学意义（χ2=8.8，P<0.05）；流感病毒（ A、B）春季均为0.65%（3/468），夏季均未检出，差异无统计学意义（χ2=2.5，P>0.05）；呼吸道合胞病毒（ RSV），春季2.2%（10/458），夏季0.3%（1/386）（χ2=5.9，P <0.05）；腺病毒（ADV），春季5.1%（24/468），夏季13.2%（51/387），差异有统计学意义（χ2=17.1，P<0.01）；EB病毒，春季16.9%（79/468），夏季17.3%（67/387），差异无统计学意义（χ2=0.02，P>0.05）；同时检出腺病毒和EB病毒共57例检出率为6.7%（57/855）。结论 EB病毒、腺病毒、副流感病毒（1、2、3）型是衡阳地区患儿上呼吸道感染的主要病原体，除EB病毒外其他病毒流行有一定季节性。
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实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用
目的 实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用.方法 本中心送检的200例手足口病疑似患者为本实验研究对象,采集所有患者粪便标本后分别进行分实时荧光PCR技术以及逆转录聚合酶链反应,观察比较两种检测方法 对EV、EV-71、CA-16病毒检出情况以及对手足口病疑似诊断情况.结果 实时荧光PCR技术对EV、EV-71、CA-16病毒检测敏感性以及准确性均明显高于逆转录聚合酶链反应,逆转录聚合酶链反应手足口病患者检出例数明显低于实时荧光PCR技术,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 对于手足口病患者进行实时荧光PCR技术可有效提高EV、EV-71、CA-16病毒阳性检出率,从而为手足口病临床检出诊断提供重要的参考依据,对降低手足口病患者误检率、漏检率具有重要的作用.
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EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究
目的 利用叠氮溴化乙錠(EMA)实时荧光PCR技术,建立直接检测食品中单增李斯特活菌的方法.方法 根据单核李斯特菌inlA基因设计特异性引物和探针.用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品前处理条件.用平板计数法验证该方法的检出限及对死菌的抑制率.用35株单增李斯特菌、25株非单核李斯特菌、92株非李斯特菌验证该方法特异性.用添加了不同剂量的单增李斯特死菌、活菌及金黄色葡萄球菌的15件饮料,15件熟肉制品进行模拟实样检测.结果 单增李斯特活菌EMA实时荧光PCR方法的Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)(R2 =0.999).低检测的活菌浓度为55 cfu/反应.对死菌DNA抑制效率≥99.98％.35株单增李斯特菌Ct值低16.21,高29.38,而25株非单单增李斯特菌、92株非单增李斯特菌的Ct值均大于35或无Ct值.重复试验Ct值变异系数小于5％.30件模拟实样单增李斯特菌的检测结果与常规方法完全一致.且EMA实时荧光PCR方法检出时间仅需10h左右,而常规分离培养方法需要5～7 d.结论 EMA实时荧光PCR检测技术是一种快速、简便、特异性强、灵敏度高、仅检测单增李斯特菌活菌的有效方法,可作为食品中检测单增李斯特活菌的方法推广使用.
关键词： 单增李斯特菌 活菌 叠氮溴化乙锭(EMA) 实时荧光PCR技术 -
遵义市2011年手足口病实验室检测结果分析
目的:了解遵义市2011年手足口病肠道病毒感染情况和年龄分布情况,为手足口病的防控提供依据.方法:收集2011年遵义市手足口病临床诊断病例1068例,其中重症病例190例.采用实时荧光PCR技术对肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)特异性RNA检测.结果:1068份手足口患者标本中,EV71阳性率28.3％ (302/1068)、CoxA16阳性率16.8％ (180/1068)、EV阳性率10.9％(117/1086)、EV71和CoxA16双阳性率3.7％ (40/1068).重症病例标本190份,EV71阳性率63.7％、CoxA16阳性率8.4％、EV阳性率7.4％、EV71和CoxA16双阳性率5.8％.结论:遵义市2011年手足口病的病原主要以EV71型为主、并且有EV71和CoxA16混合感染的病例和其他血清型的肠道病毒出现,5岁以下的儿童是肠道病毒感染的高危人群.男女儿童肠道病毒感染无明显差异.
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实时荧光PCR技术在预防性健康检查沙门菌与志贺菌检测中的应用
目的 将实时荧光PCR技术应用于食品及公共场所从业人员肛拭标本的沙门菌与志贺菌检测,评价其作为快速检测方法的适用性.方法 采集肠道门诊粪便与肛拭标本分别利用实时荧光PCR法与传统培养法进行平行对照实验,验证实时荧光PCR法的灵敏度与特异度;然后将此法与列联表结合应用于从业人员肛拭标本的检测.结果 515份肠道门诊标本的检测结果表明,实时荧光PCR法阳性率高于培养法(P＜0.05),沙门菌与志贺菌的灵敏度均为100.00％,特异度分别为98.98％、97.02％.检测2013年采集的从业人员肛拭标本21 590份,检出沙门菌18株,阳性率为0.83‰;未检出志贺菌.实时荧光PCR法检出率高于2014年同期传统培养法检出率.结论 实时荧光PCR技术有助于提升预防性健康检查中沙门菌与志贺菌的检出率,而且特异度强、灵敏度高,兼具时效性与客观性,适合基层实验室对从业人员进行沙门菌与志贺菌的快速筛查.
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尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒分型定量结果分析及临床意义
目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)分型定量检测对于临床上诊治尖锐湿疣(CA)的指导意义.方法 纳入2015年12月至2016年9月在南方医院皮肤科门诊就诊患者126例,所有患者均经临床检查确诊为CA,并经FQ-PCR检测为HPV阳性,对患者感染HPV型别及感染病毒量等参数进行回顾性分析.结果 126例患者中共检出20种基因型,以HPV6和HPV11型为主;低危组HPV平均病毒载量高于高危组;多重感染多见,占37.3％.对治疗过程中监测HPV型别和病毒载量的CA病例分析说明病毒载量变化可有效指导疗效判断.结论 HPV分型定量检测对于CA的诊断和疗效监测有着明确的指导意义.
关键词： 人乳头瘤病毒分型定量 尖锐湿疣 实时荧光PCR技术 -
利用母血胎儿游离DNA进行单基因病无创产前诊断研究进展
母血中胎儿游离DNA的发现为单基因遗传病的无创产前诊断提供了新途径.过去10年来,相继发展了多种技术(实时荧光PCR技术、焦磷酸解激活的聚合反应技术、质谱技术、数码PCR技术)用于母血胎儿游离DNA的检测,推动了单基因遗传病无创产前诊断研究的发展.现将相关技术的基本原理、存在优缺点等方面作一综述,以期对单基因遗传病无创产前诊断的发展有所帮助.
