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微小牛蜱中肠内容物菌群结构分析
目的 分析不同阶段的雌、雄微小牛蜱中肠内容物的细菌种群结构,为蜱及蜱传病防治提供科学依据.方法 无菌收集微小牛蜱中肠内容物,以试剂盒提取细菌总DNA,通过通用引物PCR扩增16S rDNA V3区并进行DGGE电泳,选取9条优势条带进行同收克隆测序.结果 微小牛蜱中肠优势菌9种,包括拉乌尔特立克次氏体,克雷伯菌,假单胞菌,生癌肠杆菌,阪崎肠杆菌,斯洛伐克立克次氏体,欧文氏菌,泛生菌,柯克斯氏体,其中,克雷伯菌、斯洛伐克立克次氏体、柯克斯氏体见于不同阶段的雌、雄微小牛蜱肠道;欧文氏菌、生癌肠杆菌仅见于雄成蜱,而泛生菌仅见于雌成蜱;阪崎肠杆菌只见于饱成蜱;雌蜱产卵后,肠道泛生菌、拉乌尔特立克次氏体优势消失;产卵5d后,蜱肠道菌群结构基本稳定.结论 不同阶段的雌、雄微小牛蜱中肠内容物的细菌种群结构存在一定程度的差别.
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维医异常黑胆质体液质高血压人群和正常黑胆质体液质健康人群肠道菌群多样性分析
目的 了解维吾尔医学异常黑胆质体液质高血压人群和正常黑胆质体液质健康人群肠道菌群结构多样性的差异. 方法 以20例异常黑胆质体液质高血压患者和20例正常黑胆质体液质者粪便中的细菌总DNA为模板,以细菌通用引物进行16SrDNA的V6～V8区域PCR扩增和DGGE分析；切取特异条带,进行克隆、测序和核酸序列比对.结果两组体液质人群检测的共有优势条带为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),检测的差异条带为肠道产丁酸细菌和疣微菌门(Verrucomicrobia),其在两组中出现的频率差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 PCRDGGE技术检测异常黑胆质体液质高血压人群与正常黑胆质体液质人群肠道菌群的多样性存在差异,其中直肠真杆菌和多形拟杆菌的存在可能会导致异常黑胆质体液质高血压的形成和发展.
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16S rRNA基因的PCR-DGGE技术分析逍遥散干预抑郁模型大鼠盲肠菌群的变化
目的：观察和寻找慢性温和不可预知应激程序( CUMS)抑郁模型药物干预后的菌群变化并鉴定具体菌种。方法SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、盐酸氟西汀组和逍遥散组；采用慢性温和不可预知应激程序( CUMS)复制大鼠抑郁模型,在第1天时除空白组和模型组给予等体积生理盐水外,其他两组分别给予逍遥散和盐酸氟西汀,28 d后取盲肠；提取盲肠基因组DNA,并对16 S rRNA基因V3可变区进行PCR扩增,构建变性梯度凝胶电泳( DGGE)指纹图谱并制定碱基序列。将PCR扩增产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混合培养,选取形成的白色菌落,进行鉴定分析。结果体重和行为学指标显示CUMS复制成功；盲肠指数显示逍遥散可回调慢性应激对盲肠所产生的影响。采用BLAST程序对盲肠菌群DGGE指纹图谱及测得的序列进行相似性分析发现Lachnospiraceae bacterium、Lactobacillus animali、Burkholderiales bacterium、Lactobacillus reu-teri四种优势菌。与空白对照组相比,Lachnospiraceae bacterium、Lactobacillus animali、Burkholderiales bacterium三种菌种的丰度在模型组均增强,Lactobacillus reuteri在模型组显著减弱。给予逍遥散后,Lactobacillus animali的丰度增强,Lachnospiraceae bac-terium的丰度不变,而其他两种细菌未检测到。结论通过DGGE分析发现抑郁症大鼠的盲肠菌群发生明显改变,逍遥散通过调节抑郁症大鼠肠道菌群的益生菌来改善胃肠功能。
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两种粪便保存方法对肠道菌群结构研究的影响
目的 比较2种粪便保存方法(室温法和Invitek公司的粪便稳定剂保存法)对菌群结构研究的影响.方法 应用PCR-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)方法,对用2种方法保存的3位志愿者粪便样品进行菌群结构的分析.结果 室温法保存粪便样品24 h后,S1个体菌群结构与原始样品的菌群结构相似度为83%,S2和S3的菌群结构与其原始样品的相似度仅为77%.而使用粪便稳定剂保存1 d,期间各时间点样品菌群结构与原始样品相比变化较小,相似度在80%～90%.结论 粪便稳定剂具有一定的稳定样品菌群结构的作用,在新鲜粪便样品不能立刻进行深冻的情况下,使用粪便稳定剂是一种较好的样品保存方法.
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小鼠肠道菌群的多样性不因大肠埃希菌O157∶H7感染而降低
目的 探讨大肠埃希菌O157∶H7感染对小鼠肠道菌群的影响.方法 采用大肠埃希菌O157∶H7菌悬液,灌胃制备感染小鼠.随后测定小鼠的生长情况和死亡率;收集肠道菌群,DGGE检测小鼠个体间肠道菌群的变化,高通量测序检测组间感染小鼠肠道菌群的变化.结果 大肠埃希菌O157∶H7感染小鼠与正常对照组小鼠相比,小鼠体重、死亡率差异无统计学意义.DGGE结果显示,在不同小鼠个体之间,它们的肠道细菌的种类和数量存在明显差异.高通量测序结果显示,大肠埃希菌O157∶H7感染小鼠肠道菌群的多样性高于对照组,但优势菌的丰度有显著变化.结论 大肠埃希菌O157∶H7感染,尽管极大改变了小鼠肠道优势菌群的比例,但没有降低其多样性.另外,小鼠个体间肠道菌群多样性的差异在微生态研究中不容忽视.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 肠道菌群 小鼠 高通量测序 DGGE -
长期使用农药的土壤微生态变化研究初探
目的 通过PCR-DEEG方法比较长期使用农药的土地和正常的土地菌群结构和数量的变化,阐述农药对土壤微生态环境的影响.方法 收集长期使用农药的土壤和未使用农药的土壤,提取细菌基因组 DNA,采用针对16S rDNA V3区的PCR-DGGE技术获得土壤菌群指纹图谱,进行相似性、多样性分析.结果 长期使用农药的实验组土壤菌群结构与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05).长期使用农药的土壤中出现四种特异性菌种:Candidatus saccharimonas、Anabaena cylindrical、Caldilinea aerophila和Sphingobiumchlorophenolicum.Streptomyces niveus、Thermoanaerobacter菌种在长期使用农药的实验组含量增多,且差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论 长期使用农药在一定程度上使土壤细菌种群的结构和数量发生变化,破坏了土壤微生态平衡.
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胆管结扎对大鼠肠道双歧杆菌组成的影响
目的 分析胆管结扎对SD大鼠肠道双歧杆菌菌群结构组成的影响.方法 采集手术前3 d和手术后2周5只模型组和5只对照组大鼠的粪便样品,提取粪便样品中微生物的混合DNA进行双歧杆菌类群特异性PCR-DGGE,结合主成分分析技术比较2组大鼠在手术前后肠道内双歧杆菌结构组成的变化.结果 DGGE图谱及其主成分分析表明手术后对照组和模型组大鼠肠道双歧杆菌菌群的结构组成明显不同,主要表现在假长双歧杆菌的数量在模型组显著增加,而动物双歧杆菌却明显减少.结论 胆管结扎导致SD大鼠肠道双歧杆菌结构发生异常变化.
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益生菌DGGE Marker的制备及验证
目的 制备指示益生菌标准菌株的DGGE marker并对其可靠性进行验证.方法 分别利用乳杆菌、双歧杆菌特异性引物和细菌V3区通用引物对选取的乳杆菌、双歧杆菌标准菌株DNA进行扩增,利用DGGE检测每个标准菌株条带位置是否与利用这些标准菌株制备的DGGE marker条带相对应.结果 DGGE图谱显示,乳杆菌和双歧杆菌特异性引物或V3区通用引物扩增后的每个标准菌株优势条带,与乳杆菌、双歧杆菌DGGE marker均有对应关系.结论 常见益生菌菌株的DGGE marker可以指示相应菌株的存在;其研制成功,可为微生物生态学中应用DGGE技术检测特定微生物种类的动态变化,提供新的思路.
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肠道硫酸盐还原菌DGGE分析技术的建立
目的 建立分析肠道内硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)组成的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术,并用于分析10例健康人粪便样品中的SRB组成.方法 从GenBank中下载13株脱硫弧菌科细菌的腺苷酰硫酸还原酶α亚基基因(aprA)的序列,利用Clustal X、Simulated PCR (SPCR)软件比较、评估了2对针对aprA 基因的引物(AprA-3-FW/APS-RV和AprA-1-FW/AprA-5-RV)用于扩增粪便样品中的SRB的特异性.确定PCR引物和条件,进一步摸索并建立DGGE分析体系.结果 Clustal X和SPCR软件分析的结果均表明引物AprA-3-FW/APS-RV优于AprA-1-FW/AprA-5-RV.实际PCR的结果也显示AprA-1-FW/AprA-5-RV扩增效率低并有非特异扩增.建立DGGE体系,对10例健康人肠道中SRB的分析显示,每个个体肠道中SRB的种类有l到5种不等.结论 基于aprA序列的DGGE技术是分析肠道SRB组成的有效方法.
关键词： 硫酸盐还原菌 腺苷酰硫酸还原酶基因 DGGE 肠道菌群 -
抗维生素D佝偻病PHEX基因突变分析
目的 研究10例家族性及非家族性(散发)抗维生素D佝偻病患者PHEX基因突变,初步探讨我国东北地区抗维生素D佝偻病患者PHEX基因突变的类型.方法 应用常规饱和酚-氯仿法提取基因组DNA,聚合酶链反应扩增PHEX基因22个外显子序列,DGGE方法结合测序检测突变.结果 3名患者检测出PHEX基因突变:患者(H11)检测出16外显子上游46 bp(T>C)突变;患者(H1,H2)检测出18外显子1861(C>T)(Gin621X)的无义突变.结论 PHEX基因突变是抗维生素D佝偻病的致病原因.检测到的这两种PHEX基因突变为国际上首次报道的新的突变类型.
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婴幼儿腹泻粪便标本菌群的16S rDNA PCR-DGGE分析
目的 探讨DGGE技术对常见肠道病原菌的区分能力及腹泻病人粪便标本中的菌群组成和变化情况.方法 采用细菌的16S rDNA V3区通用引物,以常见肠道病原菌的染色体和腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板, PCR扩增后进行DGGE分析及优势条带的序列分析.结果 6份粪便标本的DGGE图谱均表现为高度多态性,不同标本之间优势带型存在很大的差异.序列分析显示每份粪便标本中的DGGE优势带型由不同的细菌组成,而且其中非可培养细菌占较大比例,恢复期病人的粪便标本中双歧杆菌和/或乳杆菌成为优势菌型.结论 PCR-DGGE能够有效区分不同种属的常见肠道病原菌,技术可为常规的病原菌分离培养方法提供补充,用于腹泻粪便标本的菌群分析,为疾病诊断提供线索.
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慢性牙周炎患者龈下菌斑和龈上菌斑微生物群落分析
目的:分析慢性牙周炎患者龈下菌斑和龈上菌斑微生物群落结构.方法:30名慢性牙周炎患者,分别采集龈上菌斑和龈下菌斑,运用DGGE技术分析两组样本微生物群落结构,采用聚类分析(CA)、偏小二乘法(PLS)找出两组间存在明显差异的条带,通过测序确定与区别条带相近的微生物.结果:CA和PLS结果均显示慢性牙周炎患者龈下菌斑和龈上菌斑微生物群落结构存在显著差异;测序结果显示,福赛斯坦纳菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、龈沟产线菌、卡氏卟啉单胞菌、普氏菌属、简明弯曲菌是龈下菌斑的相关优势菌,而索氏密螺旋体和有害新月形单胞菌是龈上菌斑的相关优势菌.结论:慢性牙周炎患者龈下菌斑和龈上菌斑微生物群落存在生物多样性及差异.
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早期类风湿关节炎患者肠道微生物群落的分析
目的 研究类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者肠道微生物群落分布特点,探讨类风湿关节炎与肠道菌群的关系.方法 收集30例早期RA患者(RA组)与21例健康受试者(对照组)粪便样本,培养与测定肠道菌群计数水平；提取粪便样本基因组DNA,PCR扩增细菌V6-V8区16SrDNA,产物经变性梯度凝胶电泳分离,获得肠道菌群DGGE图谱,分析肠道细菌丰富度、Shannon-Wiener指数、均匀度指标,用非加权类平均法对图像进行相似性聚类分析,并绘出聚类树形图,研究RA患者肠道菌群结构与健康受试者的差异.结果 双歧杆菌含量:RA组为(6.21 ±1.48) CFU/ml,显著低于对照组(8.55 ±0.90) CFU/ml(P ＜0.01),脆弱类杆菌的含量:RA组为(6.54±1.28) CFU/ml,显著低于对照组(8.73±0.90) CFU/ml(P＜0.01),乳杆菌、梭菌、肠杆菌、肠球菌数量差异无统计学意义(P＞0.05).肠道菌群DGGE 图谱示:与对照组[丰富度:(22.8±3.12)；Shannon-Wiener指数:(2.98±0.26)；均匀度:(0.96±0.05)]相比,RA组丰富度[(16.0±1.05),P＜0.01] 、Shannon-Wiener指数[(2.48±0.14),P＜0.01]和均匀度[(0.90 ±0.05),P＜0.01]显著降低,分别表明RA患者肠道细菌的种类(丰富度)、菌群结构复杂程度、细菌的相对密度(均匀度)显著降低,在DGGE图谱下方区域RA患者肠道菌群条带数量减少,消失明显.图谱相似性聚类分析显示:20例样本聚为两类,一类样本中包含10例患者与1例健康人,二类样本中包含9例健康人.表明RA患者肠道菌群有较高的相似性,RA与健康人肠道菌群相似性低.结论 早期RA患者肠道存在菌群失调,肠道细菌数量及结构与健康人有显著差异,其差异变化可能是类风湿关节炎的发病因素之一.
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急性淋巴细胞白血病线粒体DNA突变的研究
目的:研究急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者白细胞线粒体DNA D-loop区突变情况,以探讨线粒体DNA突变与急性白血病发生发展的关系.方法:采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)和DNA序列分析相结合的方法,对15例ALL病人治疗前、缓解期及复发时白细胞线粒体基因组的D-loop片段进行突变研究.结果:以缓解期为对照, 发现8例(54%)ALL病人治疗前白细胞的线粒体DNA D-loop片段上出现突变,复发时又有相同或不同的突变出现;突变类型均为碱基替代突变,主要是C-T突变(43%);同时发现在线粒体DNA的某些位点发生突变的频率明显较高.结论:白细胞线粒体基因组的突变可能在白血病的发生发展过程中起重要作用.
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牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物群落分析
目的:分析牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物群落的结构.方法:选取30名牙周健康志愿者,分别采集龈上菌斑及唾液样本,经DNA抽提与PCR扩增细菌16Sr RNA V3区后,运用DGGE技术分析各组样本微生物群落结构;并采用主成分分析(PCA)、聚类分析(CA)及偏小二乘法(PLS)分析两组间检出水平存在明显差异的条带,通过割胶测序确定与区别条带相近的微生物.结果:PCA、CA、PLS结果均显示,牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物组成存在一定差异(P<0.05);测序结果提示,黄褐二氧化碳噬纤维菌、长奈瑟球菌和微黄奈瑟球菌在龈上菌斑内为优势菌群,而澳大利亚链球菌、谭氏普氏菌和黏滑罗斯菌在唾液内为优势菌群.结论:牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物群落存在生物多样性及差异.
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慢性牙周炎龈下菌斑和唾液微生物群落分析
目的:运用DGGE技术检测慢性牙周炎龈下菌斑和唾液微生物群落结构,分析其菌群之间的关系.方法:选取34名慢性牙周炎志愿者,分别采集龈下菌斑和唾液样本,采用PCR扩增细菌16Sr RNA V3区后,运用DGGE技术分析各组样本微生物群落结构.通过数字化软件Image J将DGGE凝胶图谱转成数字信息,对所得矩阵进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、聚类分析(Cluster Analysis)和偏小二乘法(Partial Least Squares,PLS)分析.结果:DGGE图谱显示:龈下菌斑DGGE条带数目为11～28,,平均19;唾液DGGE条带数目为11～24,平均17;PCA结果显示:龈下菌斑与唾液比较有明显的差异;聚类分析显示:龈下菌斑、唾液形成5个明显聚类群,在同一聚类群中相似度高,在不同聚类群中相似度低,表示龈下菌斑与唾液菌群之间有显著差异;PLS结果显示:慢性牙周炎龈下菌斑与唾液菌群有显著差异.结论:DGGE是一种能直观显示微生物群落的指纹技术.通过该技术能检测牙周、唾液微生物群落的结构和组成,本结果显示,慢性牙周炎龈下菌斑与唾液微生物群落结构有明显差异.
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有窦型与无窦型根尖周炎微生物群落比较
目的：分析有窦型与无窦型根尖周炎感染根管内菌群结构的差异。方法：采集17例原发性根尖周炎的根管样本，其中有窦型9例、无窦型8例。分别经 DNA 抽提和16S rRNA 基因 V3区 PCR 扩增后，利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）检测两组样本的微生物群落结构；然后分别采用聚类分析、主成分分析（PCA）和偏小二乘法（PLS）对两组样本的菌群结构进行比较，并对两组间有显著差异的相关区别条带进行割胶测序。结果：聚类分析、PCA、PLS 显示，有窦型与无窦型样本的菌群结构存在差异，共有5条区别条带的检出水平在两组间显著不同（P ＜0．05）。测序结果提示，Dialister invisus、Bacteroidetes clone＿X083、Pseudoramibacter alactolytic-us 与有窦型根尖周炎相关，而嗜糖普雷沃菌和纤细弯曲菌则与无窦型根尖周炎相关。结论：有窦型和无窦型根尖周炎感染根管内的微生物群落结构存在差异，Dialister invisus、Bacteroidetes clone＿X083、Pseudoramibacter alac-tolyticus 可能与窦道形成有关。
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龈下微生物检测方法研究的现状
龈下微生物的检测使牙周病病因学研究逐步深入.细菌培养、酶和免疫实验、DNA探针杂交以及PCR技术等方法已在临床上得到应用,理想的、精确的测量龈下微生物的技术还需要我们更进一步的探讨.
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PCR-DGGE法检测浮游生物16S rDNA在溺死鉴定中的应用
目的 建立并评估PCR-DGGE法检测浮游生物对溺死鉴定的应用价值.方法 大白兔30只随机分为3组:溺死组(n=12),死后抛尸组(n=12)和对照组(n=6);溺死组和死后抛尸组又分为2个亚组:东湖水域组(n=6)和墨水湖水域组(n=6).死后提取心血和肺、肝、肾、脑等组织,匀浆后,采用Percoll密度梯度离心法分离浮游生物并提取其DNA,PCR扩增浮游生物特异的16S rDNA片段后分别用琼脂糖凝胶电泳及DGGE检测分析.2个溺死案例检材同法检验.结果 溺死组各组织器官中浮游生物检测多呈阳性:肺(100%)、肝(83%)、肾(75%)、心血(83%)、脑(42%);死后抛尸组仅2例肺组织(16.7%)检出阳性;对照组全部阴性.溺尸肺组织DGGE分型网谱与相应溺死点水样分型图谱相似,而与非溺死点水样分型结果差异显著.2实际案例均呈阳性.结论 本方法不仅有助于定性诊断溺死,而且通过比较产物的多样性可以推断溺死地点,在法医学溺死鉴定中具有较大实用价值.
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用PCR-DGGE技术检测人外周血mtDNA HVⅠ单倍型及异质性
目的 建立简单、有效的mtDNA单倍型检测及异质性筛查技术,并获取其相应的汉族人群频率分布.方法 用PCR-DGGE技术对200例武汉汉族无关个体外周血mtDNA HV Ⅰ 15997～16174nt和16208～16401 nt区域进行分型检测.结果 200例汉族无关个体中,15997～16174nt和16208～16401nt区域分别检出20种和22种单倍型,其单倍型多样性(HD值)分别为0.8159和0.8844;mtDNA HV Ⅰ组合单倍型共90种,其HD值达0.9803.两区域分别有4名和2名个体观察到异质性,其发生率为3%.结论 PCR-DGGE是一种简单、灵敏、高效的mtDNA多态性及异质性检测技术,可应用于法医学实践.
