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旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达
目的 构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体,并且在大肠埃希菌中表达.方法 将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a(+)载体上,构建原核表达载体pET 28a-Ts43,酶切鉴定正确后,导入菌株Rosetta中,用IPTG诱导表达,并经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a-Ts43,IPTG诱导表达分子质量单位约为43 ku的融合蛋白,与预测值相符.以0.9 mmol/LIPTG诱导4.5h后表达量高,薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%.Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别.结论 原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功,为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础.
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旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定
目的 原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr) 43000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定.方法 将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性.结果 SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41000的重组融合蛋白,IPTG诱导4h时表达量大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%.Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应.结论 旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应.
