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腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究
目的 建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用. 方法 用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平.感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测. 结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统.用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48％；RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46％.MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P＞0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显.TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著. 结论 构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础.
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RhoA在食管癌中的表达及其机制研究
目的:研究RhoA基因在人食管癌中的mRNA表达及其与肿瘤发生的关系.方法:采用SYBR Green实时定量PCR技术检测30例食管癌组织及癌旁组织申的RhoA基因的mRNA水平.同时,采用免疫组化技采检测上述30例组织中RhoA的蛋白永平及分布.结果:与癌旁组织相比,RhoA基因在食管癌组织中mRNA水平较癌旁组织显著上调,癌旁组织中RhoA的表达为0.39±0.09,食管癌组织中RhoA的表达为0.94±0.25,与癌旁组织相比小上调2.4倍.免疫组化的结果也表明,RhoA基因在食管癌组织中表达要高于癌旁组织,并且主要分布于细胞浆.结论:RhoA基因在人食管癌中较癌旁组织表达显著上调,RhoA基因的表达与食管癌的发生密切相关.
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慢病毒介导RhoA基因沉默对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响
目的:建立慢病毒介导RhoA基因稳定沉默卵巢癌HO8910细胞株,研究RhoA基因对HO8910细胞侵袭和迁移的影响.方法:构建靶向沉默RhoA基因的慢病毒载体Lenti-U6-shRhoA,将其感染HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选,建立稳定沉默RhoA基因的HO8910细胞.实时荧光定量PCR检测HO8910细胞中RhoA mRNA的表达；MTT检测HO8910细胞的增殖；Transwell体外迁移和侵袭实验检测RhoA基因沉默对HO8910细胞侵袭和迁移的影响.结果:成功构建靶向RhoA基因的慢病毒载体Lenti-U6-shRhoA,建立了RhoA基因稳定沉默的HO8910细胞.与Lenti-U6-NC对照组对比,RhoA基因稳定沉默HO8910细胞RhoA mRNA的表达明显降低[(30.7±5.40)％vs(95.9±6.53)％,P＜0.05]；沉默RhoA基因能降低HO8910细胞的存活率[(51.16±7.41)％ vs(95.67 ±2.14)％,P＜0.05]；RhoA基因沉默组HO8910细胞的侵袭、迁移及黏附能力较Lenti-U6-NC对照组明显受到抑制[迁移穿过人工基底膜细胞数(31±6)vs(84±13)个,P＜0.05；穿过微孔膜的细胞数(97±12)vs(689 ±23)个,P＜0.05;黏附率(68.16±6.53)％vs(98.71±4.92)％,P＜0.05].结论:慢病毒介导的RhoA基因沉默能抑制卵巢癌HO8910细胞的侵袭和迁移.
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抑制 RhoA 基因表达诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究
目的：探讨抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌（ BC）细胞凋亡的作用。方法通过已建立的RhoA腺病毒载体系统，感染BC MCF -7细胞。经过细胞培养、病毒滴度等，将收集的样本分别用Western blot、RT-PCR技术检测RhoA 蛋白表达和基因表达变化；对感染Adsi RNA-RhoA的BC 细胞进行MTT检测及细胞内DNA片段化检测。结果腺病毒siRNA-RhoA感染BC细胞能明显抑制RhoA基因表达（抑制率为75．64％），降低RhoA基因的mRNA转录水平69．44％。 MTT检测结果表明，感染腺病毒Adsi RNA-RhoA组的肿瘤细胞生长、增殖被明显抑制。 TUNEL检测显示，抑制RhoA基因表达能明显导致BC细胞凋亡。结论利用siRNA抑制BC细胞中RhoA基因表达，能诱导BC细胞凋亡。
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RhoA、C干扰载体的构建及其对直肠癌HCT116细胞相应基因表达的影响
目的 构建RhoA和RhoC干扰载体,观察其对结直肠癌细胞内RhoA和RhoC基因表达的抑制作用.方法 设计合成针对人RhoA和RhoC基因序列的各4对含有小发夹结构的寡核苷酸序列,将其连入pGensil-1质粒中,构建特异性shRNA表达载体并转染结直肠癌细胞HCT116.应用荧光定量PCR法检测HCT116细胞中的RhoA和RhoC mRNA.结果 成功构建了特异性shRNA表达载体,将其转染HCT116细胞后,细胞内RhoA和RhoC mRNA的表达水平与未转染组相比,P＜0.05.结论 构建的RhoA和RhoC shRNA干扰载体能有效抑制HCT116细胞的RhoA mRNA和RhoC mRNA表达.
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短发夹状RNA抑制RhoA基因在HepG2细胞中的表达
目的 构建针对人RhoA基因的短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对人肝癌细胞株HepG2 RhoA表达的特异性抑制效应.方法 设计合成针对RhoA mRNA编码序列两个不同靶点的核苷酸片断,并定向克隆到真核表达载体Pgenesil-2的U6启动子下,构建重组质粒phsRNA- RhoA1和pshRNA- RhoA2,不针对任何基因组序列的重组质粒pshRNA- HK作为阴性对照.脂质体法转染到HepG2细胞后,应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)和蛋白免疫印迹法( Western- blot)分别检测RhoA基因表达的抑制效应.结果 酶切鉴定和测序结果证实重组质粒均构建成功.转染HepG2后,pshRNA- RhoA2组RhoA基因mRNA和蛋白的表达水平均显著降低,与pshRNA-HK组和空白细胞组相比,差异有统计学意义(r=- 19.28,t=-7.08,P＜0.05).而pshRNA- RhoA1组抑制效应不明显,差异无统计学意义(r=-0.16,t=-0.30,P＞0.05).结论 构建的重组质粒pshRNA- RhoA2能特异有效地抑制RhoA基因在肝癌细胞HepG2中的表达,为进一步研究RhoA基因在肝癌中的作用提供了有效的分子工具.
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RhoA与卵巢癌的研究进展
卵巢癌是女性常见的三大恶性肿瘤之一,近年来卵巢癌发病率逐年上升,但由于卵巢深藏于盆腔,其发病隐蔽,至今缺乏有效的早期诊断方法,大部分患者就诊时多为晚期,治疗及预后差,5年生存率长期徘徊在15％～30％之间.如将目前早期卵巢癌的诊断率由25％提高至75％,则可减少癌死亡人数的50％,因此研究早期卵巢癌的诊断指标,尤其是敏感指标以及基因对卵巢癌的治疗显得尤为重要.
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体外RNA干扰RhoA基因对舌癌细胞侵袭的影响
目的 应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113和SCC-4中RhoA基因的表达,探讨RhoA基因表达下调对舌癌细胞侵袭的影响.方法 登录Genbank数据库确定人RhoA基因序列,针对RhoA的基因序列设-短链RNA,利用Lipofectamine2000介导法将RhoA-siRNA转染至舌癌Tca8113和SCC-4细胞.采用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后的舌癌细胞中RhoA mRNA的表达,蛋白质印迹法检测RhoA、半乳糖凝集素-3(galectin-3)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力.结果 舌癌细胞转染RhoA-siRNA后,RhoA的基因和蛋白表达下降,galectin-3和MMP-9蛋白表达下降,细胞体外侵袭能力降低.结论 RhoA-siRNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4细胞中RhoA的表达,通过降低galectin-3和MMP-9的表达从而降低细胞的侵袭能力.RhoA在舌癌的侵袭和转移中可能发挥重要的作用.
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慢病毒和质粒作为shRNA载体沉默人卵巢癌RhoA基因效果的比较
目的 研究慢病毒和质粒作为RNA干扰载体在沉默卵巢癌RAS同源基因家族成员A(RhoA)基因表达方面的差异.方法 分别将慢病毒及质粒载体携带的针对RhoA基因的siRNA序列感染或转染卵巢癌HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选建立稳定沉默RhoA基因的细胞株.通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR、Western blot法、血管形成实验、细胞划痕实验研究两种载体随着细胞培养代数的增加在抑制卵巢癌RhoA基因表达及侵袭和转移能力上的差异.结果 采用质粒载体及慢病毒载体分别建立人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过荧光显微镜观察,质粒组细胞绿色荧光蛋白的表达率随培养代数的增加而下降；第15代、第25代时表达率分别为70％、45％,而慢病毒组细胞绿色荧光蛋白表达率维持在95％以上,实时荧光定量PCR及Western blot法发现质粒组和慢病毒组细胞在第3代时RhoA mRNA及蛋白的表达无明显差异；随培养代数的增加,慢病毒组RhoA mRNA及蛋白持续低表达,而质粒组RhoA mRNA及蛋白的表达逐渐增高；细胞划痕实验及血管形成实验表明慢病毒较质粒作为载体介导siRNA对RhoA基因沉默更能持续稳定地抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移(P＜0.05).结论 慢病毒较质粒作为载体介导RNA干扰能更好沉默目标基因的表达.
