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融合基因CPA-LTB的原核表达及其免疫原性研究
目的 获得具有良好免疫原性的产气荚膜梭菌α毒素(CPA)与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白的基因工程菌. 方法 将重组质粒pCPA LTB转化大肠埃希菌BL21 (DE3),用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白CPA-LTB.用表达产物经口服或腹腔免疫小鼠,21 d后尾静脉攻毒,观察融合蛋白的免疫原性和免疫保护性. 结果 融合基因CPA-LTB可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达产物的分子质量单位为66 ku.表达的融合蛋白可被抗LT血清和A型产气荚膜梭菌抗毒素血清识别,具有CPA和LTB抗原性.融合蛋白中的LTB部分增强了CPA的免疫原性,起到了免疫佐剂的作用. 结论 融合蛋白CPA-LTB能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达的CPA-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性.
关键词： 产气荚膜梭菌α毒素 不耐热肠毒素B亚单位 基因融合 基因表达 免疫原性 -
融合基因CPA-LTB在大肠埃希菌中表达条件的优化
目的 在构建含有CPA-LTB融合基因的重组菌株基础上,对其表达条件进行优化,以获得高效表达的CPA-LTB融合蛋白. 方法 采用限制性内切酶酶切鉴定含CPA-LTB融合基因的重组质粒pCPA LTB,然后采用均匀设计法对影响目的蛋白表达的因素和水平进行优化:设计实验方案,分别以不同浓度的IPTG和乳糖为诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS PAGE检测不同条件下融合蛋白的表达情况. 结果 双酶切鉴定重组质粒含有CPA-LTB融合基因(1700 bp),且阅读框架正确.以IPTG为诱导剂在pH7.5、诱导温度31℃、转化菌菌液A600值为1.2、IPTG终浓度0.4mmol/L诱导6h,目的蛋白表达量大,占菌体总蛋白相对含量的54％;以乳糖为诱导剂在pH 6.5、温度34℃、转化菌菌液A600值为0.6、乳糖终浓度0.1 mmol/L诱导6h,融合蛋白的表达量大,占菌体总蛋白相对含量的61％.优化前后两种诱导剂诱导表达的蛋白量分别增加63％和42％. 结论 CPA-LTB融合基因表达质粒转化大肠埃希菌在优化的表达条件下高效表达目的蛋白,为研制α毒素基因工程亚单位疫苗奠定了基础.
关键词： 产气荚膜梭菌α毒素 不耐热肠毒素B亚单位 基因融合 基因表达 优化表达 -
运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究
目的 研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素(CPα)进行检测的方法 和反应条件.方法 按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的"质量效应"对聚合酶链反应(PCR)扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响.结果 压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64 mol/L的NaCl溶液适合于检测.结论 压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段.
关键词： 产气荚膜梭菌α毒素 基因 压电石英晶体生物传感器 寡核苷酸探针 -
产气荚膜梭菌α毒素突变体构建及其卵黄抗体制备
目的 制备特异性的产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)卵黄抗体(yolk immunoglobulin,IgY).方法 利用定点突变技术,将CPA第56位天冬氨酸和第68位组氨酸分别突变为丝氨酸,构建了重组表达载体pTIG-mCPAD56S和pTIG-mCPAH68S,将其转化入E.coli Origami中进行诱导表达.用亲和层析的方法对突变体蛋白进行纯化并对其活性及抗原性进行检测,将获得的突变体蛋白分别免疫健康母鸡,收集鸡蛋;经水稀释法纯化卵黄中IgY;用酶联免疫吸附试验检测IgY效价;通过筛选保护剂而选择佳的IgY冻干条件.结果 与结论 pTIG-mCPA在Origami表达菌株中得到高效表达,经验证,mCPAD56S和mCPAH68S均完全失去生物学活性同时保留抗原性;纯化卵黄后得到较高纯度的特异性IgY,其效价可达到1∶200 000;经过IgY冻干条件的筛选,终选择不添加保护剂大量冻干IgY作为抗体的储备.该研究为研制基于IgY抗体的检测方法奠定了基础.
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产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化
目的 克隆产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perqingens alpha-toxin,CPA)全基因,在大肠埃希菌(E.coli)中表达并纯化α毒素.方法 设计并合成CPA的全基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-CPA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化表达条件,并对重组蛋白进行纯化.结果 双酶切和测序鉴定结果表明,CPA基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中;表达的重组蛋白相对分子质量约为43 000,主要以可溶性形式表达,佳培养基为TB培养基,佳诱导温度为37 ℃,诱导时间为3h;纯化的重组蛋白纯度达95％以上,浓度为0.663 mg/ml,收率为5 mg/g湿菌.结论 成功在E.coli中表达了CPA,纯化后的CPA纯度较高,为进一步研究其结构、功能、致病机制及制备抗α毒素人源单链抗体奠定了基础.
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产气荚膜梭菌α毒素及其检测
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起人畜创伤性气性坏疽的主要致病菌,按所产毒素种类,分为A、B、C、D、E5个型别,这5个型别产生的毒素共有12种,起主要作用的毒素只有4种,即α、β、ε和ζ,各型均产生α毒素(CPα)[1].CPα是引起严重创伤性气性坏疽的主要致死因子,所引起的气性坏疽治疗困难,预后差.
