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融合基因CPA-LTB的原核表达及其免疫原性研究
目的 获得具有良好免疫原性的产气荚膜梭菌α毒素(CPA)与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白的基因工程菌. 方法 将重组质粒pCPA LTB转化大肠埃希菌BL21 (DE3),用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白CPA-LTB.用表达产物经口服或腹腔免疫小鼠,21 d后尾静脉攻毒,观察融合蛋白的免疫原性和免疫保护性. 结果 融合基因CPA-LTB可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达产物的分子质量单位为66 ku.表达的融合蛋白可被抗LT血清和A型产气荚膜梭菌抗毒素血清识别,具有CPA和LTB抗原性.融合蛋白中的LTB部分增强了CPA的免疫原性,起到了免疫佐剂的作用. 结论 融合蛋白CPA-LTB能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达的CPA-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性.
关键词： 产气荚膜梭菌α毒素 不耐热肠毒素B亚单位 基因融合 基因表达 免疫原性 -
融合基因CPA-LTB在大肠埃希菌中表达条件的优化
目的 在构建含有CPA-LTB融合基因的重组菌株基础上,对其表达条件进行优化,以获得高效表达的CPA-LTB融合蛋白. 方法 采用限制性内切酶酶切鉴定含CPA-LTB融合基因的重组质粒pCPA LTB,然后采用均匀设计法对影响目的蛋白表达的因素和水平进行优化:设计实验方案,分别以不同浓度的IPTG和乳糖为诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS PAGE检测不同条件下融合蛋白的表达情况. 结果 双酶切鉴定重组质粒含有CPA-LTB融合基因(1700 bp),且阅读框架正确.以IPTG为诱导剂在pH7.5、诱导温度31℃、转化菌菌液A600值为1.2、IPTG终浓度0.4mmol/L诱导6h,目的蛋白表达量大,占菌体总蛋白相对含量的54％;以乳糖为诱导剂在pH 6.5、温度34℃、转化菌菌液A600值为0.6、乳糖终浓度0.1 mmol/L诱导6h,融合蛋白的表达量大,占菌体总蛋白相对含量的61％.优化前后两种诱导剂诱导表达的蛋白量分别增加63％和42％. 结论 CPA-LTB融合基因表达质粒转化大肠埃希菌在优化的表达条件下高效表达目的蛋白,为研制α毒素基因工程亚单位疫苗奠定了基础.
关键词： 产气荚膜梭菌α毒素 不耐热肠毒素B亚单位 基因融合 基因表达 优化表达 -
淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜佐剂的融合表达
目的: 在大肠埃希菌(E.coli)中表达淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜免疫佐剂的融合蛋白. 方法: PCR扩增淋病奈瑟菌保守抗原表位porin loopⅥ～Ⅷ(PL678)基因,并与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合,转化E.coli, ELISA、SDS-PAGE及Western印迹分析其表达. 结果: 融合蛋白获得表达, 具有结合GM1神经节苷酯的能力和与抗淋病奈瑟菌多克隆抗体的反应性. 结论: 融合蛋白的表达为研究淋病奈瑟菌分子内佐剂疫苗奠定了基础.
关键词： 淋病奈瑟菌 不耐热肠毒素B亚单位 融合表达 -
幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化
目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2+-NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.
关键词： 幽门螺杆菌 不耐热肠毒素B亚单位 融合蛋白 -
大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究
目的研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因工程菌的发酵工艺.方法先通过摇瓶培养初步确定工程菌的适生长条件,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件,并进一步对发酵工艺进行改良优化.结果经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的佳组合,优化后工程菌菌体产量平均可达40.5 g/L,目的蛋白的表达率平均为30.6%.结论建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺.
关键词： 产毒素性大肠杆菌 不耐热肠毒素B亚单位 发酵 -
大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合表达载体的构建及应用
目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体.方法 PCR扩增LTB基因,并在其3′端去掉终止密码子,引入编码TAPI接头,通过EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点重组于Pinpoint Xa-Ⅰ载体上,将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合,转化E.coli JM109, SDS-PAGE及Western blotting分析其表达.结果成功构建了LTB融合表达质粒,并获得了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合表达.结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内佐剂疫苗奠定了实验基础.
关键词： 不耐热肠毒素B亚单位 融合表达 载体 -
应用Hoefer GE 200 Gel Eluter纯化重组的LTB
目的纯化基因重组表达的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB).方法采用Hoefer GE 200 Gel Eluter从聚丙烯酰胺凝胶中回收LTB蛋白,SDS-PAGE,HPLC分析其纯度,western-blot分析其免疫学性质.结果电洗脱1次可获得300 μg重组蛋白,纯化蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳表现为单一蛋白质带,HPLC检测纯度为99.46%,免疫印迹证实其保持有免疫学活性.结论该系统纯化LTB蛋白操作方便、快捷,所得蛋白纯度好、回收率高.
关键词： 基因重组 不耐热肠毒素B亚单位 蛋白纯化 -
产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位可有效诱导和增强对肠道病毒71型的黏膜免疫应答
目的 研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性.评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果.方法 构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清,ELISA检测抗血清效价.用纯化的EV71 VP1、LTB联合EV71 VP1、生理盐水分别经鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集血清、肺和小肠黏膜冲洗液,采用间接ELISA检测IgG和分泌性IgA(sIgA).结果 已成功构建重组质粒pET32a-LTB.表达的6×His-LTB融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,免疫兔所制备的抗血清效价为1∶125 000.EV71VP1联合LTB组的小鼠特异性IgG和sIgA水平较EV71 VP1单独免疫组和对照组有明显增高.结论 在E.coli BL21 (DE3)中成功表达了6×His-LTB融合蛋白,纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性.通过滴鼻免疫,LTB可有效增强特异性血清抗体反应,诱导黏膜免疫应答.
关键词： 不耐热肠毒素B亚单位 肠道病毒71型 免疫原性 黏膜免疫
