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壳聚糖纳米纤维支架对猪肝细胞分泌猪内源性逆转录病毒的影响
探讨壳聚糖纳米纤维支架对肝细胞的PERV分泌量以及其感染性的影响.将新鲜分离的猪肝细胞接种于壳聚糖纳米纤维支架或普通条件下连续培养7d,分为实验组（Nano组）和对照组（Hep组）.每天收集培养液检测逆转录酶(RT)活性,并通过RT-PCR和实时定量PCR测定PERV RNA水平.通过western blot检测细胞裂解液中PERV gag 30蛋白含量.细胞培养液体外孵育HEK293细胞以测定其感染性.结果表明:实时定量PCR、RT活性以及western blot具有相似的变化趋势.在体外培养10 h和2d出现PERV分泌高峰然后逐渐下降.除第6dPERV RNA水平和第5d蛋白水平实验组明显高于对照组外,其余均无明显差异.体外感染实验无HEK293细胞感染.壳聚糖纳米纤维支架会延长猪肝细胞的PERV分泌时间但对分泌量以及体外感染性并无明显影响,可安全用于生物人工肝.
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猪内源性逆转录病毒透过生物人工肝的影响因素
目的 病毒安全性是猪源性生物人工肝(BAL)不可忽略的安全问题.本研究旨在探讨影响BAL中猪内源性逆转录病毒(PERV)透过的因素.方法 构建双循环的新型猪源性BAL.两循环间采用膜孔径为10 nm、20 nm、30 nm和35 nm的血浆成分分离柱以及500 nm膜孔径的血浆过滤柱分隔两循环.反应器内填充共培养的猪肝细胞-骨髓间充质肝细胞或原代猪肝细胞并连续循环72 h.每12 h抽取内、外循环内培养液检测PERV RNA、逆转录酶(RT)活性以及其体外感染性.结果 血浆过滤柱组中,内外循环内PERV检测结果完全相同,提示500 nm血浆滤过柱对PERV并无阻隔作用.在血浆成分交换柱各组中,各时间点内循环中均能检出RNA和RT活性,但是外循环中并未检出RT活性,而且随着膜孔径减小,RNA的检出时间逐渐延迟,且内循环RNA水平逐渐增加.各培养液均未发现能够体外感染HEK293细胞.结论 膜孔径、循环时间以及内循环病毒浓度是影响BAL中PERV透过的主要原因.
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猪逆转录病毒与生物人工肝及细胞移植
生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的研究热点,猪肝细胞因其来源广泛、功能稳定、解剖及生理与人相近、不易患病等优点成为目前生物人工肝及细胞移植使用较多的生物材料之一,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染体外培养人细胞以来,跨种族间感染越来越引起人们的重视.本文拟就该病毒在生物人工肝及细胞移植中的研究进展综述如下.
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异种移植免疫学及其潜在风险的研究进展
同种器官移植成功率的提高导致了供体器官的严重短缺.采用解剖学上与人类相近的动物,比如猪的器官可以解决这种危机.但从猪到人的器官移植需要克服很多障碍,包括免疫学,生理学及其伦理道德问题.超急性排斥反应是猪到人异种器官移植的首要免疫学障碍,目前主要通过敲除半乳糖α1,3半乳糖(galactose-α1,3-galactose,Gal)抗原来克服超急性排斥反应.除此之外,仍有其它的非-Gal抗原可能引起猪到人的移植物的失功,例如N-羟乙酰神经氨酸等.除了免疫学障碍,猪器官携带的病毒及可能引起的异种移植的潜在风险也不容忽视.虽然现在还没有明显的实验数据显示猪到人的病原体的感染,但当猪到人的免疫学障碍被克服后,感染将成为又一研究热点.
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四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究
目的 检测四种小型猪在内源性逆转录病毒基因(PERV)拷贝数上的差异,试图找出不舍或含有较低拷贝数的个体或品种.方法 采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数.结果 贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221).尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义.结论 四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,表明其用于异种器官移植研究的可行性.
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新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究
目的:探讨猪肝细胞为基础的新型生物人工肝(BAL)系统体外灌流后及治疗急性肝衰竭(ALF)犬后猪内源性逆转录病毒(PERV)的传播.方法:构建新型BAL,应用BAL进行体外灌流6h.采用门腔分流及胆总管结扎切断术建立犬ALF模型,应用BAL治疗ALF犬6h.采用PCR检测灌流前猪细胞中PERV原病毒DNA和猪mtDNA,采用RTPCR检测灌流前后中空纤维管内腔循环液和治疗前后犬血清PERV RNA.结果:猪细胞可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA,灌流前后中空纤维管内腔循环液和犬血清PERV RNA均为阴性.结论:猪肝细胞为基础的新型BAL体外灌流和用于ALF犬治疗6h后未发现PERV传播.
关键词： 肝功能衰竭 生物人工肝系统 猪内源性逆转录病毒 逆转录-聚合酶链反应 -
猪内源性逆转录病毒在家猪细胞中的检测
目的 研究家猪(大白猪×杜洛克猪)体内猪内源性逆转录病毒(PERV)的存在和表达.方法 采用PCR方法检测猪外周血单个核细胞、肝细胞中PERV前病毒序列;用RT-PCR方法检测家猪血清中PERV RNA序列.结果 PCR方法测定猪外周血单个核细胞、肝细胞阳性率分别为40%、100%,RT-PCR方法测定家猪血清阳性率为33.3%.结论 家猪体内有PERV的存在和表达,但其外周血单个核细胞、血清PERV的阳性率分别较中国实验用小型猪、大白猪为低,说明不同猪种之间PERV的存在和表达存在较大差异,筛选PERV基因拷贝数低甚至无PERV存在和表达的猪种是今后猪器官细胞医学应用的一个方向.
关键词： 家猪 猪内源性逆转录病毒 聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应 -
长白与青海八眉"二元杂交"猪种群PERV亚型分析
目的 研究长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)亚型,为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据.方法从长白与青海八眉"二元杂交"猪种群中随机采集33头个体外周血,应用PCR和RT-PCR技术分别检测PERV前病毒DNA和mRNA,研究该种群携带PERV 的亚型,并对PCR扩增的灵敏性进行评估.克隆测序该猪种PERV env基因,结果用NCBI中的BLAST软件进行分析.结果所检测的33头个体均带有PERV前病毒DNA,外周血中均有PERV mRNA表达,其中,69.7 %(23/33)个体携带 env-A,env-B 和env-C 三种囊膜蛋白基因,而其余的30.3 %(10/33)个体只带有env-A 和env-B 两种囊膜蛋白基因,env-C 基因缺失.灵敏性分析实验结果表明,PCR扩增PERV 时,DNA模板不能少于15 ng.克隆 env-A,env-B 和env-C基因,结果提交GenBank(GenBank登录号分别为DQ856326、DQ856327、DQ856328).生物信息分析结果表明,该猪种env 基因与GenBank 登录其他猪种序列相比存在差异,其中env-A、env-B基因发生移码突变,蛋白合成提前终止.结论长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带PERV,69.7 %个体为PERV-ABC 亚型;缺失突变使PERV env-A,env-B 基因阅读框发生改变,有可能影响其感染特性,从生物安全性方面综合考虑,该猪种不宜作为异种移植供体.
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人源细胞对猪内源性逆转录病毒易感性的初步研究
目的对6种人源细胞对猪内源性逆转录病毒(PERV)的易感性进行研究.方法用PERV病毒上清感染培养中的6种人源细胞后,用PCR和RT-PCR法研究PERV是否感染这6种人源细胞.结果张氏肝细胞和人胚软骨细胞对PERV不易感,其余4种人源细胞对PERV易感.结论不同组织来源的人源细胞对PERV的易感性是不同的.
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猪内源性逆转录病毒在异种移植中的感染风险
猪作为异种移植供体可有效解决人类同种移植供体短缺的问题,但猪内源性逆转录病毒具有潜在的感染风险,严重影响了猪器官、组织、细胞在临床中的应用.因此,在异种移植应用于临床前,阐明猪内源性逆转录病毒的感染风险性至关重要.
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异种移植微囊化新生猪胰岛细胞受体感染PERV潜在风险分析
目的:研究新生猪胰岛细胞(neonatal pig islets,NPIs)经微囊化后异种移植到狗体内,受体感染猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的风险.方法:将10只狗随机分成实验组和对照组,分别移植微囊化猪胰岛细胞和未被微囊化猪胰岛细胞.应用放射免疫的方法检测狗体内血清特异性猪C-肽以判断胰岛移植物活性;采用免疫组织化学技术检测28 d后肝移植部位是否有微囊化猪胰岛细胞;PCR和RT-PCR技术分别检测不同时间点狗外周血中PERV及猪mt DNA.结果:移植微囊化猪胰岛细胞2周后,给受体注射葡萄糖,15～30 min狗的外周血中猪C-肽表达明显升高,而对照组检测不到猪C-肽;免疫组化结果表明,狗肝脏移植部位周围可检测到少量微囊化猪胰岛细胞,肝组织无明显异常;PCR和RT-PCR结果表明,移植微囊化猪胰岛细胞在不同时间点狗外周血内均未检测到猪mt DNA及PERV表达,而对照组于移植后4 d内检测到猪mt DNA及PERV呈微弱表达,10 d后均未见表达.结论:微囊化猪胰岛细胞能够在受体肝脏内存活并发挥作用,受体内不存在PERV的感染,提示海藻酸钠微囊可以有效地防止猪mt DNA及PERV的穿越,可能在异种移植中具有较好的应用前景.
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湖南大围子猪内源性逆转录病毒的研究
目的:研究湖南大围子猪携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV),为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据.方法:从湖南大围子猪的保种群内随机采集42头个体的耳样组织,应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中PERV前病毒DNA和mRNA,并对PCR扩增的灵敏性进行评估.扩增、测序大围子猪的PERV env基因,结果用美国生物信息中心(National Center for Biotechnology Information)的BLAST软件进行分析.结果:所检测的42头大围子猪均带有PERV前病毒DNA,耳样组织中均有PERV mRNA表达,所有个体携带env-A,env-B和env-C 3种囊膜蛋白基因.测序结果表明,大围子猪env-A和env-C与GenBank登录其他猪种序列(AY288779,AY534304)相比分别存在1和8个碱基的差异,而env-B基因没有碱基差异.结论:大围子猪种群携带PERV,而且均具有转录活性,亚型主要为PERV-ABC;大围子猪的PERV env-A,env-C存在基因多态性,从生物安全性方面考虑,该猪种不宜作为异种移植供体.
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异种器官移植中猪内源性逆转录病毒的检测
猪来源的细胞、组织和器官可用于多种疾病治疗.但存在猪传染性病原体感染人体宿主的风险,包括含有3种亚型的猪内源性逆转录病毒(PERVs):PERV-A,PERV-B和PERV-C.异种器官移植的检测应包含筛选猪群的来源(PERV-A和PERV-B和PERV-C表达水平的检测)和受体的筛选(区分PERV之间的转递性和嵌合性).这些测有助于降低PERV传播感染的可能性并对提高异种器官移植的安全性具有重大的意义.
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异种移植中预防传染性病原体传播的研究进展
异种移植中采用猪的细胞、组织和器官可能导致猪传染性病原体的转移,进而感染人受体,甚至引发人畜共患的疾病.为防止此情况发生,应对供体动物进行广泛的微生物筛选,包括细菌、病毒、真菌和其他微生物.在进行移植之前,供体猪可进行长时间的筛选,故异种移植将比同种异体移植变得更为安全.通过实施剖腹产、接种疫苗等策略可以筛选出不转移不传播微生物的供体动物.猪内源性逆转录病毒(PERV),整合于所有猪的基因组中,上述方法不能清除PERV,因此需选择病毒低表达的猪或构建PERV表达抑制的基因修饰猪.
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异种移植临床研究指导意见(2018建议版)
为推进异种移植临床研究的安全、顺利开展,规范异种移植临床研究行为,根据相关法律和规范,中华医学会器官移植学分会异种移植学组从总则、项目申请与审查、技术标准、伦理要求、生物安全、项目管理、供体要求、受者选择、项目实施、追踪随访等方面,制定了异种移植临床研究指导意见(2018建议版).
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猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定
目的研究猪内源性逆转录病毒在体内和体外的感染性,建立理想的细胞模型,为猪一人间跨种移植的生物安全性评价奠定良好的基础.方法运用组织块培养法、冷胰蛋白酶方法及热胰蛋白酶方法培养猪皮肤成纤维细胞,比较3种方法的优点和缺点.结果建立了猪皮肤成纤维细胞系组织块培养法优于胰酶法.结论应用组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞优于胰酶法,经济实惠、操作简便、易于掌握;并为研究PERV在体内和体外的感染性提供了理想的细胞模型,为评估猪一人间跨种移植的生物安全性提供一种新的方法;对建立动物克隆生产的皮肤体外培养模式具有重要的参考价值.
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中国版纳微型猪近交系内源性逆转录病毒酶活性的定量检测
采用Roche公司的RT(Reverse transcriptase, RT)检测试剂盒,按其操作步骤进行,用HIV-1作为试剂盒的阳性参照绘制标准曲线,PK15作为猪内源性逆转录病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)的阳性对照,定量检测34头中国版纳微型猪近交系(Banna minipig inbreed ,BMI)血浆中表达的PERV的逆转录酶.各猪RT结果均于405 nm处测定OD值,用HIV-1的实测标准曲线进行定量(pg/ml).检测结果表明全部34头猪均为阳性反应,但各猪血浆中有活性的酶远低于HIV-1,也弱于PK15细胞株的培养上清.
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猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究
目的检测猪内源性逆转录病毒(PERV)在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达.方法通过提取已建立的版纳微型猪近交系(BMI)骨髓间充质干细胞 (MSCs) 永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT-PCR方法检测PERV前病毒gag、pol和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定. 结果从原代BMI-MSCs至连续传代到150、180代的BMI-MSCs细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达,PERV亚型为PERV-A、B型. 结论 PERV在BMI近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消失,PERV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达.
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中国两种地方猪种内源性逆转录病毒的亚型分析
目的对两种中国地方猪种(五指山猪和版纳微型猪近交系)的86头个体进行猪内源性逆转录病毒(PERV)亚型分析. 方法取引物EnvA、EnvB和EnvC分别用于鉴定PERV的A、B和C亚型,并对86头个体进行PCR法分析. 结果在所有被检测个体中,77.9%的个体的基因组中同时有PERV的A、B两种亚型,另外22.1%的个体的基因组中则只有PERV的A或B亚型;所有个体的外周血白细胞中均未检测到PERV的C亚型. 结论 PERV在中国五指山猪和版纳微型猪近交系的外周血白细胞中只有A、B两种亚型,并且以AB的混合亚型为主.
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猪内源性逆转录病毒及其敲除抑制方法
猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）是一种以前病毒DNA形式整合入猪基因组中的逆转录病毒，它可随细胞基因组的复制而复制。部分猪源细胞可释放PERV病毒颗粒，并能感染多种体外培养的人源细胞。由于猪器官大小和解剖生理与人体器官相似，被认为是异种器官移植的佳供体。但猪基因组内的 PERV 存在跨物种间感染风险，以猪源器官作为器官供体移植人体后可能导致 PERV 感染人体。PERV 感染是异种器官移植的一大障碍，从生物安全性考虑，需要去除或抑制猪基因组内PERV，以降低其物种间传播风险。因此，本文对PERV的生物学特征及近年来PERV的去除和抑制方法等方面的研究进展进行了综述。
