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组织因子途径抑制因子对涤纶人工血管材料表面血栓形成影响的体内研究
组织因子是机体外源性凝血途径的起始因子,研究证实它与生物材料在机体内诱发的血栓形成密切相关,我们以前进行的体外研究发现用组织因子的抑制因子-组织途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)处理生物材料可以明显延长在其表面发生的凝血时间.本文进一步探讨了重组TFPI处理涤纶人工血管材料对其植入动物血管内后诱发血栓的影响.本研究中将涤纶人工血管材料裁成细条并浸润于谷胱甘肽硫基转移酶(glutathione-S-transferase, GST)或GST-TFPI融合蛋白溶液中置4℃过夜,然后植入实验犬的双侧股动脉,随时记录股动脉的搏动情况,2h后取出材料进行血栓称重.我们的结果显示重组TFPI处理材料可以明显延长动脉闭塞时间及减少材料表面的血栓形成,这提示TFPI在改善生物材料血液相容性方面的巨大应用潜力.
关键词： 生物材料 血液相容性 组织因子途径抑制因子 -
组织因子途径抑制因子与肝脏疾病
组织因子途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制物,主要由微血管内皮细胞合成,通过调节组织因子依赖的外源性凝血途径来发挥抗凝作用,并与抗炎、缺血性心脏病及恶性肿瘤等密切相关.在慢性肝病、肝硬化患者早期,肝脏微血管内皮细胞受到持续应激、感染和炎性刺激,组织因子过度表达,TFPI反馈性增高.在严重肝病或肝硬化并发门静脉血栓形成(portal vein thrombosis,PVT)时,TFPI由于大量消耗而降低.重组TFPI可预防PVT形成、降低弥散性血管内凝血的死亡率及改善炎症感染,为临床上预防和治疗肝硬化及并发症提供了新的思路.
关键词： 组织因子途径抑制因子 慢性肝病 肝硬化 -
人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中的表达与纯化
目的 利用毕赤酵母高效表达人组织因子途径抑制因子(TFPI).方法 利用基因定点突变技术对人TFPI cDNA特定序列进行定点突变(同义突变).将获得的突变体及野生型cDNA分别插入表达载体pPic9中,转化酵母宿主菌GS115和KM71,用0.5%的甲醇诱导重组蛋白表达.细胞培养上清经超滤浓缩后,依次用DEAE-sepharose Fast Flow、Heparin-sepharose CL6B及 Sephadex G-75柱层析分离纯化得到重组蛋白,分别采用凝胶扫描成像定量分析和底物显色法测定重组蛋白的表达量和活性.结果 凝胶扫描成像定量分析显示,同义突变体的表达量(1 mg/L)显著高于天然型(0.1 mg/L).活性测定表明GS115重组菌在诱导表达12 h后即可于培养上清中检测到TFPI活性,36 h达峰值;而KM71重组菌诱导表达24 h后才开始于培养上清中检测到TFPI活性,72 h达峰值.两个菌株中突变体mTFPI-pPic9转化子的表达量均显著高于TFPI-pPic9转化子.重组蛋白相对分子质量约为42 000.结论 对TFPI-cDNA特定序列进行同义突变后能显著提高重组蛋白在毕赤酵母细胞中的表达,且显著高于在酿酒酵母和昆虫细胞的表达;重组蛋白具有良好的生物活性.因此,利用毕赤酵母表达TFPI是一种较好的选择.
关键词： 组织因子途径抑制因子 毕赤酵母 同义突变 -
组织因子途径抑制因子及其医学应用前景
外源凝血途径起始于组织因子/FⅦa活性复合物的形成.组织因子途径抑制因子是主要的凝血抑制因子之一,通过和TF/FⅦa以及Fxa形成四聚体抑制这一过程.研究表明,组织因子途径抑制在诸如动脉粥样硬化,血管再狭窄,弥漫性血管内凝血等疾病可能有潜在的治疗功能.
关键词： 组织因子途径抑制因子 动脉粥样硬化 血管再狭窄 弥漫性血管内凝血 -
人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中高拷贝表达
目的 构建高拷贝表达重组人组织因子途径抑制因子的毕赤酵母并对蛋白表达条件进行初步优化,为相关研究奠定基础.方法 将PCR扩增得到的TFPI cDNA片段与表达质粒pPIC9K连接构建重组质粒rhTFPI-pPIC9K,采用PCR方法及DNA测序对其进行鉴定.将重组质粒转化酵母细胞GS115,利用G418抗性实验筛选含有高拷贝TFPI cDNA的毕赤酵母菌株,采用Western Blot和TFPI检测试剂盒分析重组蛋白表达.通过改变诱导温度、诱导时间及甲醇浓度对重组蛋白表达条件进行初步优化.结果 PCR扩增rhTFPI-pPIC9K得到预期的扩增条带(1.2 kb),经酶切图谱分析及测序确认成功构建表达质粒rhTFPI-pPIC9K.实时定量PCR结果显示,通过G418筛选获得了含高拷贝基因的酵母细胞,Western Blot 结果显示含基因拷贝数与蛋白表达量呈正相关.通过对表达条件的优化,明显提高了TFPI重组蛋白的表达量,重组TFPI表达量高达(9.95+0.78)mg/L,活性达到(3.91+1.37)U/mL.结论 成功构建了高效表达TFPI重组蛋白的毕赤酵母细胞株,为TFPI功能研究及在相关疾病防治中的应用提供了坚实的实验基础.
关键词： 组织因子途径抑制因子 毕赤酵母 表达 -
组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达
目的:构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 313细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体.方法:以含有全长DNA的plR ES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFPl-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFPl-Nuc-TFPI.将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达.结果:经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高.结论:成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达.
关键词： 组织因子途径抑制因子 绿色荧光蛋白 双顺反子表达载体 血管再狭窄 -
真核表达载体pCMV-(Kozak)TFPI的构建及其在内皮细胞中的表达
目的 构建真核表达载体pCMV-(Kozak)TFPI并检测其在内皮细胞中的表达,为冠状动脉旁路移植和经皮冠状动脉内成形术中转染血管内皮细胞抗凝治疗作了实验和理论的探索.方法 用RT-PCR的方法提取人组织因子途径抑制因子(TFPI)基因,并引入Kozak序列,将(Kozak)TFPI亚克隆入pCMV质粒中.在阳离子脂质体介导下,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC).RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测HUVEC中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达.结果 (Kozak)TFPI成功克隆入pCMV中.RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测到外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达.结论 成功构建了pCMV-(Kozak)TFPI真核表达载体,并表达出相应的蛋白.
关键词： 冠状动脉旁路移植术 经皮冠状动脉内成形术 组织因子途径抑制因子 基因 载体 转染 -
壳聚糖载基因纳米粒子的研究
以壳聚糖为基质研究载基因纳米粒子的制备及其对血管平滑肌细胞的转染效率.制备载绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)和组织因子途径抑制因子(Tissue factor pathway inhibitor, TFPI)质粒DNA的壳聚糖纳米粒子,透射电镜观察两种纳米粒子皆呈球形,光子相关色谱仪(PCS)测定显示纳米粒子的平均粒径为149 nm,粒径分布在80～250 nm 之间;载基因纳米粒子的DNA包埋效率和DNA含量分别为96%±1.38%和37%±3.0%.载基因壳聚糖纳米粒子可以有效地保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用.血管平滑肌细胞转染实验表明,纳米粒子对细胞基本无毒性,其转染效率与阳离子脂质体转染试剂LipofectAMINETM相近.
关键词： 壳聚糖 纳米粒子 基因 组织因子途径抑制因子 细胞转染 -
人组织因子途径抑制因子重组蛋白表达菌株的建立
组织因子途径抑制因子是机体凝血过程的主要抑制因子,在血栓形成性疾病的防治中具有广阔的应用前景.本研究采用 pGEX-2T 为表达载体、大肠杆菌细胞为表达宿主进行了人组织因子途径抑制因子重组蛋白的制备.制备的重组蛋白产量较高,纯化过程简 单,且具有良好的抑制组织因子的功能.
关键词： 组织因子途径抑制因子 重组蛋白 大肠杆菌 -
组织因子途径抑制因子对生物材料表面血小板粘附的影响
组织因子途径抑制因子(tissue factor pathway in hibitor, TFPI)是组织因子凝血途径的主要抑制因子，具有抑制组织因子、凝血因子VIIa、 和Xa的功能。我们以前的研究显示TFPI在体外可以明显延长被修饰材料表面的凝血时间，在 体内显著减少材料表面的血栓形成。本文观察了TFPI包被对聚乙烯和聚氯乙烯材料表面血小 板粘附的影响。结果显示，通过TFPI处理后，上述两种材料表面的血小板粘附数目较对照组 明显减少，提示TFPI可通过抑制血小板在材料表面的粘附起到改善生物材料血液相容性的作用。
关键词： 生物材料 血液相容性 组织因子途径抑制因子 -
人组织因子途径抑制因子基因转染对移植静脉新生内膜的影响
目的 为减少冠状动脉旁路移植术后移植静脉再狭窄,探讨人组织因子途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)基因转染对移植静脉内膜增生的影响. 方法 构建真核表达质粒pCMV-(Kozak)TFPI.将48只日本大耳白兔随机分为3组,每组16只,即TFPI转染组、空载体对照组和空白对照组.建立颈总动脉旁路移植模型.吻合前,TFPI转染组移植静脉内采用阳离子脂质体pCMV-(Kozak)TFPI(400μg)和腔内加压灌注法(30 min)转染,空载体对照组以空质粒pCMV(400 μg)代替pCMV-(Kozak)TFPI,空白对照组不予干预.术后3 d,用RT-PCR、Westernblot和免疫组织化学法检测外源基因在移植静脉中的表达.术后30 d,血管多普勒测移植静脉管腔内径和管壁厚度;组织病理标本测量内膜面积和中膜面积,并计算其比值;透射电镜观察移植静脉新生内膜的细胞构成. 结果 TFPI转染组移植静脉中有人TFPI基因mRNA和蛋白表达,两对照组未见表达.TFPI转染组移植静脉管腔内径为(2.68±0.32)mm,大于空载体对照组(2.41±0.23)mm和空白对照组(2.38±0.21)mm,差异均有统计学意义(P＜0.05).TFPI转染组管壁厚度为(1.09±0.11)mm,小于空载体对照组(1.28±0.16)mm和空白对照组(1.34±0.14)mm,差异均有统计学意义(P＜0.01).TFPI转染组移植静脉内膜面积和内膜、中膜面积比值分别为(0.62±0.05)mm2及0.51±0.08,均小于两对照组的(0.70±0.05)mm2、0.58±0.06及(0.72±0.04)mm2、0.59±0.08(P＜0.05);中膜面积各组差异无统计学意义(P＞0.05).透射电镜观察,TFPI转染组移植静脉内膜未见甲滑肌细胞,两对照组均见甲滑肌细胞. 结论 人TFPI基凶转染减少移植静脉内膜增生.
关键词： 冠状动脉旁路移植术 组织因子途径抑制因子 移植静脉 再狭窄
