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长距离PCR检测重型血友病A病人凝血因子Ⅷ基因倒位
为了筛查山东省重型血友病A(hemophilia A, HA)凝血因子Ⅷ基因倒位的患者并检出携带者,采用长距离DNA扩增(LD-PCR)方法,以0.6%琼脂糖凝胶电泳技术,检测临床上确诊的55例重型HA患者及其家系成员中是否存在凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位.电泳出现11 kb带,示凝血因子Ⅷ基因倒位;12 kb带,示非倒位;这两条带同时出现者为凝血因子Ⅷ基因倒位携带者.结果表明:55例无亲缘关系的重型HA患者中,发现22例患者(或家系成员)有凝血因子Ⅷ基因倒位,占重型HA患者的40%;15个家系中查出基因倒位携带者5名.结论:运用LD-PCR技术可以准确、简便、快速地检测重型血友病A患者是否存在凝血因子Ⅷ基因倒位.
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长距离PCR技术的建立及其在重型血友病甲Ⅷ因子倒位基因诊断中的应用
血友病甲(HA)是由于凝血因子Ⅷ基因缺陷所致的X-连锁遗传性出血疾病,其基因突变高度异质.1993年,Lakich和Naylor分别发现,此前多年来找不到FⅧ基因缺陷的约半数重型HA的患者,是由于FⅧ基因第22内含子(IVS22)内的F8A1与其远端约400～500kb处高度同源的序列F8A2或F8A3发生基因倒位所致.迄今,国际上检测这种基因倒位都是用Southern印迹杂交技术.虽然这种技术能够准确地查出是否有基因倒位,并能区分远端倒位与近端倒位等不同的类型,但此技术操作步骤繁多,流程长,出结果慢,难度大,且要操作放射性同位素标记的探针等.我们从1996年开始在国际上率先研究利用长距离DNA扩增技术(LD-PCR)替代Southern印迹杂交进行FⅧ基因倒位的诊断.经二年努力终获成功,并进行了推广应用.
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血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子1及22倒位分析
目的 对血友病A(HA)患者及其家系携带者进行凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子1及22倒位分析,并探讨其与FⅧ抗体产生的相关性.方法 对157例HA患者进行FⅧ活性(FⅧ:C)及FⅧ抗体检测;同时采用双管多重PCR及长距离PCR(LD-PCR)技术对其中81例HA患者进行FⅧ内含子1及内含子22倒位分析;并对其中6例患者进行家系调查.结果 81例HA患者中3例为内含子1倒位,均为重型,占重型HA的4.6%(65例中3例);内含子1倒位患者中1例为FⅧ抗体阳性.用该基因信息对1个内含子1倒位患者家系的2名女性进行了检测,1例为携带者,1例为非携带者.81例HA患者中25例为内含子22倒位,均为重型,占重型HA的38.5%(65例中25例),内含子22倒位患者中发现1例为FⅧ抗体阳性.用该基因信息对5个内含子22倒位患者家系的9名女性进行了检测,7例为携带者,2例为非携带者.结论 内含子1倒位是继内含子22倒位外导致重型HA的另一重要分子发病机制.FⅧ内含子倒位检测不仅可用于血友病直接基因诊断、进行家系调查;同时还可纠正表型分型的偏差.FⅧ内含子1和内含子22倒位可能是抗体产生的高危因素之一.
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倒位PCR技术在血友病A基因诊断中的应用及改进
目的 对倒位PCR(I-PCR)技术进行改进并应用于血友病A凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位突变的检测,探讨其产前诊断价值.方法 选取了8个无血缘关系的血友病A家系,应片j已改进的I-PCR技术直接检测FVS基因第22内含子倒位.对2名孕妇分别于妊娠22及26周抽取胎儿脐静脉血,在检测脐血血浆FⅧ活性的同时应用I-PCR技术进行产前FⅧ基因突变检测.结果 8个家系中检出4个家系为FⅧ基因倒位;根据FⅧ活性及基因突变检测结果 ,2名胎儿均诊断为正常胎儿.1名已出生.经随访与产前诊断结果 相符合.结论 应用I-PCR技术可以快速有效地进行血友病A FⅧ基因倒位突变的检测并可作为产前诊断的辅助手段.
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LD-PCR直接基因诊断重型血友病A的研究
目的:检测凝血因子VIII基因倒位,提高对重型血友病A患者及其携带者的诊断水平.方法:根据患者的出血症状及遗传史,采用国际通用的一期法检测患者血浆凝血因子VIII活性(FVIII:C),ELISA法检测血浆vWF:Ag浓度,确诊血友病A及其携带者;对38例重型HA患者及其母亲或姨母,采用长距离DNA扩增(LD-PCR)技术检测是否存在凝血因子VIII(FVIII)基因倒位,进行直接基因诊断.结果:38例无亲缘关系的重型血友病A患者中,发现15例患者(或家系)有FVIII基因倒位,占重型患者的41%;该15个家系中查出基因倒位携带者5名.结论:利用LD-PCR检测FVIII基因倒位技术可以准确、简便而快速地直接进行重型血友病A的基因诊断和携带者检测.
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应用长距离PCR技术对60例重型血友病甲进行Ⅷ因子基因倒位的基因诊断
目的对天津60例重型血友病甲(hemophilia A, HA)患者作出有无FⅧ基因倒位的基因诊断.方法外周血提取DNA,通过长距离PCR(long distance-polymerase chain reaction, LD-PCR)扩增,0.6%琼脂糖凝胶电泳图谱诊断FⅧ基因倒位.只有11 kb条带者即为FⅧ基因倒位;只有12 kb条带者为野生型,即非倒位;出现11 kb、12 kb两条带者为该倒位携带者.结果被检测的60例患者中21例有FⅧ基因倒位,占35%.结论 LD-PCR技术可用于直接诊断FⅧ基因倒位,是重型血友病甲直接基因诊断的有效方法.
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75例血友病A患者内含子22及1基因倒位情况分析
目的：观察血友病A（ HA）患者凝血因子Ⅷ（ FⅧ）基因内含子22倒位和内含子1倒位情况。方法：取75例HA患者静脉血，采用长距离PCR扩增技术（ LD-PCR）检测内含子22和内含子1倒位情况，观察两种内含子倒位发生率，同时观察内含子22倒位在重型HA中的比例，比较有家族史和无家族史HA患者内含子22倒位发生率。结果：检出22号内含子倒位患者27例，检出率36%（27/75），全部为HA重型患者，占重型血友病A患者的57.4%（27/47）；27例中有21例有家族史，有家族史患者内含子22号倒位的发生率高于无家族史患者（P﹤0.05）；检出内含子1倒位1例，占1.3%（1/75）。结论：FⅧ基因内含子22倒位患者患重型HA的几率较高，内含子22倒位检测在重型HA的基因诊断中具有重要意义。
