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利用动员的外周血造血干细胞建立人源化小鼠模型
目的:观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的人外周血中CD34+造血干细胞(HSC)在免疫缺陷NPGTM(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtml vst/vst)小鼠模型上造血重建的水平.方法:用免疫磁珠分选G-CSF动员人外周血CD34+的造血干细胞,经骨髓腔移植到亚致死剂量照射的NPG小鼠.移植后2、4周观察小鼠血象恢复情况;移植后4、6、8、10、12周用流式细胞仪动态监测小鼠外周血人源CD45+、CD19+细胞表达;12周后处死各组小鼠,检测骨髓、肝脏、脾脏中细胞表面CD45+、CD19+细胞表达;用PCR方法检测小鼠骨髓细胞人Alu基因的有无.结果:免疫磁珠分选人的CD34+造血干细胞纯度可达96.3％;NPG小鼠经过照射后骨髓腔内有核细胞及巨核细胞数量均明显减少或消失,达到了清髓的效果;移植组小鼠4周外周血各系血细胞恢复到移植照射前水平;所有小鼠全部存活,移植组小鼠在4、6、8、10、12周均检测到人源CD45+、CD19+细胞;应用PCR方法检测移植组小鼠人Alu基因均为阳性.结论:经骨髓腔途径移植G-CSF动员的人外周血CD34+干细胞至NPG小鼠,可以建立人鼠嵌合模型.
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人骨髓CD34+干细胞分离培养及血管内皮生长因子165诱导分化的作用
背景:有研究证实,骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能.目的:体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞,并检测其免疫学表型,观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:骨髓来源于健康供者.方法:利用Percoll梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞.采用脂质体介导转染法,选生长良好的传代细胞,以血管内皮生长因子165基因转染人骨髓CD34+干细胞.主要观察指标:采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型.经血管内皮生长因子165基因转染后,人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况.结果:体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞,细胞形态呈成纤维细胞样.CD44、CD29和c-kit阳性,CD31和CD54阴性;经血管内皮生长因子165诱导后,人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44表达降低,CD31升高,呈现典型的内皮细胞表型,并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力.结论:采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离,可培养扩增}H高度同源的CD34+干细胞,经血管内皮生长因子基因转染后,CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型,验证了其具有向内皮细胞分化的潜能.
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人脐血CD34+细胞在NOD/SCID小鼠上有效重建造血系统
目的 探讨人脐血CD34+造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(no obese diabetic/severe combined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠模型上造血重建的作用.方法 利用密度梯度离心法,从新鲜脐血中分离出单个核细胞,利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射后的NOD/SCID小鼠体内,移植后3、7、10、14 d分别用断尾法取小鼠外周血,血常规计数外周血动态变化情况;移植后4、6、8、10周,取其外周血,运用PCR法检测外周血中人特异性Alu基因的表达情况.结果 免疫磁珠分选得到的CD34+细胞浓度达91.2%,照射后小鼠骨髓腔内有核细胞和巨细胞数量明显减少或消失,达到清髓目的.移植后第3天移植组小鼠外周血各系细胞均明显低于正常组(P<0.01),移植后第7天,移植组小鼠外周血象开始恢复,明显高于阴性对照组[白细胞:(3.90±0.53)×109/L vs (1.30±0.18)×109/L,血红蛋:(139.8±5.0)g/L vs (79.8±11.0)g/L,白血小板:(253.0±17.5)×109/L vs (52.0±6.9)×109/L,(P<0.01)],移植后第10天,移植组小鼠外周血象恢复到辐照前水平,与正常组无差别.移植4周后,PCR方法 在小鼠外周血中可检测到人特异Alu基因序列,未移植组小鼠照射后2周内全部死亡.结论 经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合模型.NOD/SCID小鼠经照射后,不破坏骨髓造血微环境及造血基质,可用于异基因细胞移植模型.人脐血CD34+细胞移植入NOD/SCID小鼠,其造血系统能有效重建.
关键词： 人脐血 NOD/SCID小鼠 CD34+干细胞 造血重建 -
人脐血CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内重建体液免疫的实验研究
目的 探讨人脐血CD34+造血干细胞(HSC)在NOD/SCID小鼠模型体内体液免疫功能重建的作用.方法 从新鲜脐血中分离出单个核细胞(MNC),利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内,移植后4、6、8、10周分批处死存活的小鼠,取其脾脏和外周血,分别进行细胞表型分析、体液免疫分析,监测小鼠体液免疫功能重建情况.结果 照射2周后,阴性对照组小鼠全部死亡,6周后移植组小鼠存活率为37.5％,空白对照组小鼠存活率为100％.移植4、6、8、10周移植组外周血人CD45+细胞表达(％)分别为4.87±1.23、9.22±2.07、12.34±2.38、8.14±2.36,CD19+B淋巴细胞表达(％)分别为1.07±0.50、2.17±0.95、3.34±0.90、1.67±0.90.移植后10周,在移植组小鼠脾脏可见CD19+B淋巴细胞分布.结论 经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合免疫模型.缺少相应细胞因子刺激,CD34+细胞分化能力随时间减弱.
关键词： 人脐血 NOD/SCID小鼠 CD34+干细胞 免疫重建
