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原核表达戊型肝炎病毒基因重组结构蛋白免疫保护恒河猴的初步实验研究
目的观察基因重组戊型肝炎病毒(HEV)结构蛋白对恒河猴戊型肝炎野病毒攻击的保护作用.方法用HEV重组结构蛋白免疫恒河猴,猴血清中抗-HEV升高后,与空白对照组一同用HEV野病毒攻击,采血观察野病毒攻击前后ALT和HEV抗体等的动态变化.结果野病毒攻击后第3周,空白对照组5只猴ALT均出现明显异常,而免疫接种组5只猴ALT均正常,未观察到明显的肝脏炎症表现.结论 HEV重组结构蛋白免疫恒河猴之后,可以有效地保护HEV野病毒的攻击.该HEV重组结构蛋白可作为戊型肝炎基因工程疫苗的候选蛋白.
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基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化
目的 制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础.方法 采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923 ～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中.用大肠杆菌BL21( DE3) plysS表达重组质粒,用液相色谱法纯化基因重组蛋白.结果 PCR扩增产物为358 bp,其ATG和TGA之间的结构与人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp区完全一致.基因重组质粒在大肠杆菌BL21( DE3) plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中.纯化的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,表观分子量约为13 000.结论 人sorl1 cDNA的5 923 ～6 260 bp片段在原核细胞中大量表达,纯化后的基因重组蛋白可尝试用于抗体的制备.
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用基因重组蛋白rTPA16与rTPA38检测结核病人血清IgG抗体
[目的]探讨结核分支杆菌重组rTPA38和rTPA16在结核病免疫学诊断中的应用价值.[方法]以rTPA16、rTPA38重组蛋白为抗原,用酶联免疫吸附试验(ELISA),检测结核病人、其他肺部疾病患者、卡介苗接种后结核菌素试验阳转者血清中的抗体,并与结核病菌素试验结果比较.[结果]rTPA16、rTPA38蛋白与结核菌素试验阳性率,82例结核病人血清分别为56.1%、68.3%、78.0%,61例非结核病病人血清分别为9.8%、6.6%、18.0%;与结核菌素试验比较,用rTPA16、rTPA38蛋白检测的特异性分别为84.78%、89.29%.[结论]重组蛋白用于检测结核抗体具有较好的特异性,对结核病的血清学诊断有较高参考价值.
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重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
目的 克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA,构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白(rTCS)后,分析rTCS和nTCS(天然天花粉蛋白)对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法 RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+)并转化入BL21(DE3)细胞.IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白,MTT法分别检测rTCS和nTCS处理24、48和72 h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.结果 1.成功克隆获得TCS的cDNA并构建pET-28a(+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在.在一定的时间范围内(0～8 h);rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4.MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对He-La宫颈癌细胞的生长具有抑制作用.在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS时HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义(P<0.05);rTCS的IC50小于nTCS.结论 本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a(+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS.
