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戊型肝炎病毒第Ⅳ基因型毒株中和抗原表位的鉴定
目的 确定在我国新发现的戊型肝炎病毒(HEV)第Ⅳ基因型毒株的中和抗原表位特征及其与世界各地其他基因型HEV毒株中和抗原表位的异同.方法 制备HEV第Ⅳ基因型ORF2重组衣壳蛋白p166Chn及其单克隆抗体(McAb),采用体外中和试验鉴定McAb的中和活性;通过间接ELISA和免疫印迹法测定中和性McAb与不同基因型HEV ORF2编码蛋白p166的免疫反应性,并结合相加ELISA确定p166Chn中和抗原表位的分布和性质.结果 获得6株稳定分泌抗-p166Chn McAb的杂交瘤细胞株,所得McAb能在体外中和HEV中国毒株(第Ⅳ基因型)对PLC/PRF/5细胞的感染性,并与来源于HEV 4种不同基因型代表株的7种p166重组蛋白(p166Chn、p166Bur、p166Mor、p166Pak、p166Mex、p166Us和p166Nz)均能发生阳性反应,抗体间的相加ELJSA结果为阴性,表明6株McAb识别p166上的同一个中和抗原表位.结论 在我国新发现的HEV第Ⅳ基因型毒株与分布在世界各地的其他基因型毒株具有共同的中和抗原表位.
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一个能诱生戊型肝炎病毒中和抗体的ORF2编码蛋白短片段
目的:比较戊型肝炎病毒(HEV)第4基因型ORF2编码蛋白片段pN472-C617(aa 472～617)和pN477-C613(aa 477～613)的免疫原性,找到能诱生HEV中和抗体的ORF2编码蛋白的更短片段.方法:表达和纯化pN472-C617和pN477-C613,分别免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA检测免疫血清的抗体效价,并以基于PCR的体外中和试验检测免疫血清的中和活性.结果:pN472-C617和pN477-C613可在大肠杆菌高效可溶性表达,纯化后的重组蛋白能在小鼠体内诱导出高效价的抗体.基于PCR的体外中和试验显示pN472-C617免疫血清可有效中和HEV,阻断其在敏感细胞表面的吸附和细胞内复制;而两端仅比pN472-C617各短5个氨基酸的pN477-C613的免疫血清不具有中和HEV的活性.结论:重组蛋白pN472-C617具有良好的抗原性和诱生中和抗体的能力,是目前文献报道中含有HEV中和抗原表位的短ORF2编码蛋白片段,可作为重组亚单位候选疫苗用于HEV疫苗的开发.
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丙型肝炎病毒中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达.方法 从含HBV全序列的质粒pHBV中扩增HBV S抗原基因,在HBV S疏水区127和128位氨基酸序列处引入Age Ⅰ酶切位点,将HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位及HVR1的模拟表位基因分别插入该位点,获得嵌合HCV中和抗原表位的重组HBV S基因,将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组真核表达质粒pCI-HBSE1～4.将4种重组真核表达质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测嵌合基因的表达.结果 4种重组真核表达质粒经双酶切证实构建正确；4种重组质粒转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western blot显示,在相对分子质量约27 000处可见蛋白条带.结论 成功构建了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因真核表达质粒,其在293T细胞中可有效表达,为进一步制备嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原VLP,研究中和抗体对HCV假病毒颗粒(HCVpp)和JFH-1HCV体外培养系统(HCVcc)感染的抑制作用奠定了实验基础.
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HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
目的 制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定.方法 采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体pCI-HBSE1、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3、pCI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBsAg定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应.结果 电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度高的VLPs-SE2 HBsAg含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平.结论 成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础.
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载体和基因片段的选择对戊型肝炎病毒基因免疫抗原表达的影响
目的:比较不同载体和不同大小的目的基因片段对戊型肝炎病毒(HEV)基因免疫抗原表达的影响,为基于HEV中和抗原表位的HEV基因免疫提供一定的依据.方法:将含Ⅳ型HEV中国株中和抗原表位的p166和p179片段编码基因分别克隆入pTR421和pCDNA3.1两种真核表达载体,用脂质体介导基因转染HepG2人肝癌细胞系,经间接免疫荧光和Western blot分析以及将质粒注射小鼠局部肌肉组织后经免疫组织化学染色检测,分析目的基因在体内外的表达水平.结果:成功构建了pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179四种重组质粒,经限制性内切酶双酶切和核苷酸测序鉴定,编码基因正确无误;pTR421-179转染的细胞以及注射小鼠的局部肌肉组织可以检测到p179的表达,而pCDNA3.1-179、pCDNA3.1-166以及pTR421-166均检测不到目的基因在体内、外的抗原表达.结论:载体和目的基因片段的选择显著影响HEV抗原在体内、外的表达,直接关系到基因免疫的成功与否.
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一种新型戊型肝炎病毒样颗粒的表达、纯化及其免疫原性
目的:以非包涵体形式表达含戊型肝炎病毒(HEV)中和抗原表位的新型HEV重组蛋白,并对其进行鉴定和分析.方法:将HEV开放阅读框架2(ORF2)编码452～617位氨基酸的基因片段连接到载体pET28a(+),转化大肠杆菌,获取表达克隆.以Ni-NTA层析柱纯化表达的蛋白,并用SDS-PAGE、Western blot和直接电镜负染等方法分析鉴定,后免疫小鼠检测特异性抗体的产生水平.结果:表达的重组蛋白天然可溶,相对分子质量(Mr)约为22 000,并可形成直径为20 nm左右的病毒样颗粒,能与戊型肝炎患者血清发生Westem blot阳性反应,免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性抗体.体外中和试验显示产生的抗体具有中和HEV的活性.结论:原核表达的、含HEV中和抗原表位的、长度仅166个氨基酸的HEV ORF2近3'端编码蛋白能够形成病毒样颗粒,而且该新型病毒样颗粒具有良好的抗原性和免疫原性.
