基于汉逊酵母 HPV68b L1蛋白的 VLPs免疫学效果研究

目的：对重组表达HPV68 b L1蛋白的汉逊酵母工程菌进行高密度发酵，并对L1蛋白形成的类病毒颗粒（virus-like particles，VLPs）进行纯化、鉴定及免疫学效果评价。方法 HPV68b L1的酵母工程菌经过发酵，系列纯化和颗粒重构后获得VLPs抗原，对该抗原进行蛋白纯度、颗粒形态及免疫原性等检定，与铝佐剂吸附后免疫动物，利用假病毒体外中和试验评价其对HPV68 b型及HPV68a型的保护效果。结果发酵后的工程菌经过纯化和颗粒重构后，获得纯度大于95％的VLPs，电镜结果显示，其颗粒形态均一，大小与天然病毒颗粒接近。假病毒体外中和试验结果显示， HPV68b型VLPs抗原可诱导小鼠体内产生较高滴度的中和抗体，同时对HPV68a型也具有一定的交叉保护作用。结论验证了重组HPV68 b型VLPs蛋白用于疫苗生产的可行性，可作为多价HPV疫苗的组分。

重组水蛭素抗栓及抗弥漫性血管内凝血作用的实验研究

水蛭素(hirudin)为中医活血化淤药水蛭的主要有效成分,系由65个氨基酸组成的单链多肽,是迄今作用强的特异性凝血酶抑制剂,具有很强的抗凝、抗栓活性,对多种血栓疾病具有预防和治疗效果.目前国内外采用基因重组技术研制水蛭素取得了令人瞩目的进展.重组水蛭素(recombinant hirudin,r-hirudin,rH)产品中仅变异体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ具有抗凝活性,简称HV1,HV2和HV3.国内有关单位采用甲基营养型汉逊酵母真核表达系统研制出的rH与天然水蛭素HV1不同之处除rH-63位酪氨酸脱硫酸基外,还有N末端为N-Ile1-Thr2型,这为国内外首创.本文研究了此种rH的抗动、静脉血栓及抗家兔急性弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)作用,旨在为水蛭素新药开发提供实验研究资料.

接种第二剂乙肝疫苗后死亡1例报告

患儿,男,2013年12月8日出生,出生孕周39+6周,Apgar评分10分,出生体重4050 g,顺产,母乳喂养。2014年1月15日上午,在市医院预防接种门诊接种第二剂重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母,大连汉信生物制品公司生产,批号：201207078,有效期至2015年7月27日),接种剂量10μg/0.5 ml,于右上臂三角肌肌内注射。接种时身体健康,接种后观察30 min未发现异常回家。

重组(汉逊酵母)乙型肝炎疫苗致过敏性紫癜一例

患者女,21岁.在右上臂三角肌肌肉注射重组(汉逊酵母)乙型肝炎疫苗(recombinant hepatitis B vaccine,大连高新生物制药有限公司生产,国药准字S20040016,产品批号2004060102)0.5 ml.1 d后出现全身皮肤瘙痒,并出现米粒样大小的出血斑.

肠道病毒71型类病毒颗粒在汉逊酵母中的表达及其免疫原性

目的 于汉逊酵母中表达肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)类病毒颗粒(virus-like particle,VLP),并分析其免疫原性.方法 将鉴定正确的重组质粒pMV-P1-3CD转化汉逊酵母AU0501,经筛选获得稳定整合P1和3CD基因的重组菌株pMV-P1-3CD/AU.30 L发酵罐培养重组菌株,发酵产物纯化后进行SDS-PAGE、Western blot、HPLC检测、电镜分析及动态光散射分析检测.采用不同方法制备EV71疫苗,分别免疫小鼠和家兔,检测动物血清中和抗体几何平均滴度(GMT),评价其免疫原性及不同佐剂对疫苗免疫原性的影响.结果 重组菌株pMV-P1-3CD/AU表达产物及疫苗原液的SDS-PAGE分析显示,于相对分子质量26 000、33 000和35 000处均可见VP3、VP1和VP0蛋白条带,且相对分子质量33 000的蛋白可与EV71-VP1单克隆抗体发生特异性结合;疫苗原液的纯度达99％以上;电镜观察可见30 nm的VLP,颗粒均一度较好;小鼠血清GMT高可达1 536,家兔血清GMT高可达586,磷酸铝佐剂及氢氧化铝佐剂均可明显提高小鼠血清GMT.结论 于汉逊酵母中成功实现EV71的P1和3CD基因的共表达,可形成EV71 VLP,且具有良好的免疫原性,为今后EV71 VLP疫苗的研制提供了实验依据.

重组汉逊酵母表达的HBsAg P24亚基间二硫键桥联程度等生化性状分析

目的 分析重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的HBsAg(HP-HBsAg)P24亚基间二硫键桥联程度等生化性状.方法 采用蔗糖垫层离心法检测HBsAg的浮力密度,SDS-PAGE分析HBsAg P24亚基间结合程度的变化,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析HBsAg VLP在硫氰酸盐处理前后百分含量的变化.以酿酒酵母(Saccharomyces cervesiae,SC)表达的HBsAg(SC-HBsAg)作为对照.结果 HP-HBsAg的浮力密度为(1.085±0.014) g/ml,与SC-HBsAg的浮力密度[(1.090±0.009) g/ml]接近.SDS-PAGE分析表明,未经硫氰酸盐处理时,HP-HBsAg不能进入分离胶,而SC-HBsAg能进入分离胶;经硫氰酸盐处理后,HP-HBsAg和SC-HBsAg均不能进入分离胶.HPLC分析表明,流动相中含SDS时,HP-HBsAg VLP的百分含量在经硫氰酸盐处理前后变化不明显,SC-HBsAg VLP的百分含量在经硫氰酸盐处理后较处理前升高;在经硫氰酸盐处理前后,HP-HBsAgVLP的百分含量均高于SC-HBsAg.结论 HP-HBsAg的浮力密度与SC-HBsAg相近,HP-HBsAg P24亚基间二硫键桥联程度较高,结合紧密,不需要经硫氰酸盐处理.

重组HBsAg在汉逊酵母中的分泌表达

目的 构建重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌型汉逊酵母工程菌株,并进行诱导表达.方法 在HBsAg基因前加酿酒酵母α前导肽(MFα)基因序列作为信号肽,将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,采用搭桥PCR方法分别合成后,通过1对引物PCR法融合在一起.将融合基因插入汉逊酵母穿梭质粒pDGXHP2.0的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子下游,构建成多拷贝分泌型重组表达载体.将其电转化多型汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌ATCC34438(Ura3-),筛选分泌表达HBsAg的汉逊酵母工程菌株,并比较在YPD、BMMY、MM 3种培养基中分泌表达HBsAg的水平,ELISA检测培养上清液中HBsAg的表达量,透射电镜观察类病毒颗粒(VLPs).结果 构建了HBsAg汉逊酵母多拷贝表达质粒pDGXHP2.0-2MFα-HBsAg和pDGXHP2.0-4MFα-HBsAg,筛选获得了分泌表达HBsAg的汉逊酵母HP/2MFα-HBsAg和HP/4MFα-HBsAg.经诱导,工程菌株在YPD培养基中分泌表达的HBsAg量高于在BMMY和MM中的表达量;ELISA定量检测表达量高可达10 μg/ml,培养上清液经透射电镜观察,形成了VLPs.结论 HBsAg在汉逊酵母中能够分泌表达,并能形成VLPs,但表达量低于胞内表达量.

N-末端核定位序列对猪圆环病毒衣壳蛋白病毒样颗粒在汉逊酵母中组装的影响

目的 探讨N-末端核定位序列(nuclear localization signal,NLS)对猪圆环病毒2型(porcine circovims type 2,PCV2)衣壳蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)中组装的影响.方法 分别构建表达PCV2ORF2全长及NLS截短型重组表达质粒pMOXZ-full和pMOXZ-△N40,电转至HP,构建重组酵母表达菌株full-HP和△N40-HP,获得的两种表达产物经蔗糖密度梯度超速离心及超滤后,Western blot法检测两种表达产物的单体蛋白表达和VLP组装效率,透射电子显微镜观察VLP形态,小鼠免疫试验检测VLP的免疫原性,地高辛标记DNA杂交法检测VLP的DNA结合能力.结果 与全长ORF2表达产物PCV2-VLP(full)比较,NLS截短型表达产物PCV2-VLP(△N40)的单体表达量略有提高,但VLP组装效率及DNA结合能力均降低.两种VLP颗粒形态相近,直径约20 nm;两种VLP免疫小鼠血清的抗体几何平均滴度(GMT)差异无统计学意义(P＞0.05).结论 去除NLS可提高PCV2衣壳蛋白VLP单体的表达水平,但不是VLP组装所必须的,且可使VLP的组装率略有降低.本研究为PCV2-VLP结构和疫苗的研究奠定了基础.

WorkBeads系列介质与C4介质层析纯化汉逊酵母表达的HBsAg效果的比较

目的 比较WorkBeads 40/10000 Bus low系列3146VL、3147L、3148H、3149VH4型不同丁基密度的疏水层析柱与BIA CIM Monoliths C4纯化汉逊酵母表达的HBsAg的效果.方法 将HBsAg溶于不同的上样缓冲液中,分别上样于4型WorkBeads预装层析柱和C4丁基层析柱,用不同的洗脱缓冲液洗脱,分别收集上样流穿峰和洗脱峰,测定HBsAg含量,并计算HBsAg的流穿率和洗脱率,筛选佳上样缓冲液和洗脱缓冲液.结果 3147L型柱适于HBsAg纯化工艺,含4％硫酸铵的20 mmo1/LPB是理想的上样缓冲液,20 mmol/L PB和含30％异丙醇的20 mmol/L PB均不是理想的洗脱缓冲液.CIMMonoliths C4佳上样缓冲液是含3％硫酸铵的50 mmol/LMOPS和含4％硫酸铵的20 mmol/L PB;含0.1％ Triton-100的50 mmol/L MOPS是佳的洗脱缓冲液.结论 可多次重复使用的WorkBeads系列介质和可耐受高流速的快速纯化介质CIMMonoliths C4均可用于汉逊酵母表达的HBsAg的纯化.

重组汉逊酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原疏水层析图谱的峰形规律分析

目的 探讨疏水层析纯化重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)层析图谱与蛋白含量及HBsAg含量的相关性.方法 采用疏水层析纯化8批HP-HBsAg小量试验样品和5批小量验证试验样品及5批酿酒酵母表达的HBsAg对照试验样品,采用Lowry法和电化学发光法(Electrochemiluminescent immunoassay,ECLIA)分别检测纯化样品中蛋白含量和HBsAg含量,并计算HBsAg的回收率；通过几何法封闭紫外监测图谱特征峰图形,用数字求积仪采用积分法求出各封闭特征峰的图形面积,并进行分析；取小量验证试验1批样品的层析主峰和副峰收液进行电镜观察.结果 8批HP-HBsAg小量试验和5批HP-HBsAg小量验证试验HBsAg的平均回收率分别为70％和54％.HP-HBsAg疏水层析图谱由两部分构成:穿透峰和目标峰(HBsAg峰),目标峰可见高低不同的两个峰(主峰与副峰)；对照图谱中有穿透峰和目标峰.对目标峰进行量化分析,主峰、副峰与目标峰的面积比值分别与其所对应的收集量、蛋白含量和HBsAg含量比值相关.电镜观察可见小量验证试验样品主峰收液中HBsAg颗粒大小均一,副峰收液中HBsAg颗粒大小不均一.结论 疏水层析纯化重组HP表达的HBsAg效果良好,通过峰形之间面积比值,可获得峰形所对应的收集量、蛋白量和HBsAg量比值,为HBsAg的进一步纯化提供了参考.

重组汉逊酵母表达的HBsAg纯化工艺中内毒素的去除效果

目的 分析重组汉逊酵母表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)各纯化工序样品中内毒素的去除效果.方法 采用鲎试剂法检测重组汉逊酵母表达的HBsAg小量工艺探索、中量工艺验证、中试纯化工艺中破碎细胞、微滤、超滤、硅胶吸附、层析、除菌过滤各工序样品的内毒素含量,计算内毒素去除率,分析各纯化工序与内毒素去除率的关系,并以重组酿酒酵母表达HBsAg各纯化工序中样品作为对照.结果 重组汉逊酵母表达的HBsAg纯化过程中内毒素含量由细胞破碎样品的241 EU/ml以上降至除菌过滤样品的1.0 EU/ml以下.微滤和超滤样品内毒素去除率平均可达56％和86％,占总体纯化工艺中内毒素去除率的90％以上.结论 重组汉逊酵母表达HBsAg纯化工序微滤、超滤和疏水层析均可有效去除内毒素,以超滤去除内毒素效果明显,为重组汉逊酵母纯化工艺去除内毒素的研究提供了技术参数和实验依据.

酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展

构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等,是研发新生物制品的趋势之一,实现酵母工程菌的高密度发酵是维持制品生产规模和降低成本的重要技术途径.本文就影响酵母工程菌高密度发酵的因素,包括菌株的生物学特性和发酵_[艺特点、培养基种类及配方、发酵罐结构及性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等及在生物制品和生物制药行业中酵母工程菌细胞高密度发酵的进展作一综述.

汉逊酵母高密度发酵表达乙型肝炎表面抗原的甲醇流加控制策略

目的 考察不同甲醇流加策略对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)高密度发酵表达重组乙型肝炎表面抗原的影响.方法 在细胞生长阶段采用DO/pH在线测量的控制方法,使酵母细胞密度达到一个较高水平,诱导期比较DO-Stat/pH-Stat法和离线检测甲醇两种控制流加甲醇的方法,同时也比较用甘油和甲醇双碳源间断流加法与单纯流加甲醇法对目的 蛋白表达的影响.结果 诱导期用DO-Stat和pH-Stat法不能有效地提高乙肝表面抗原表达量,而离线检测甲醇的控制方法,在诱导阶段可将甲醇浓度控制在0～5 g/L的范围,乙肝表面抗原表达量比DO-Stat/pH-Stat法提高了20%.甲醇氧化酶(MOX)酶活性的变化与乙肝表面抗原表达量变化存在对应关系,交替加入甘油和甲醇双碳源刺激,可以使乙肝表面抗原表达量达到395 mg/L.结论 已筛选出优化工艺配置,并建立了切实可行的规模化生产工艺.

汉逊酵母重组表达的人乳头瘤病毒58型类病毒颗粒的免疫效果

目的 评价基于汉逊酵母系统的重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLP)的免疫效果.方法 将HPV58 L1重组汉逊酵母工程菌转种于3.7L发酵罐中,经甲醇诱导15h,收集菌体,高压均质破碎菌体后,采用亲和层析法纯化重组HPV58 L1蛋白,纯化后的HPV58 L1经重构后,经透射电镜观察VLP形态,动态光散射仪分析比较重构与未重构VLP粒径大小及分布情况.将HPV58 L1蛋白(1 μg/ml)及HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)分别免疫BALB/c小鼠,免疫后4周采血分离血清,假病毒中和试验比较铝佐剂吸附与未吸附免疫效果;将HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)免疫5组BALB/c小鼠,每组免疫时间均为0、1、3、5、7周,于初次免疫后第1、2、4、6、8周采血,分离血清,假病毒中和试验检测HPV58 L1免疫效果.结果 纯化后的重组HPV58 L1蛋白纯度约90％,可与小鼠抗HPV58 L1单克隆抗体发生特异性结合,在相对分子质量约56 000处,可见特异性条带.重构的HPV58 L1VLP直径约为50 nm,界限清晰,颗粒均一度较高,更接近天然病毒的颗粒形态;流体力学直径与天然病毒颗粒更接近,颗粒大小分布更均一,无较小半径的单体或五聚体.HPV58 L1蛋白+佐剂免疫小鼠血清中和抗体滴度明显高于HPV58 L1蛋白免疫组,差异有统计学意义(P＜0.05);5组小鼠血清中和抗体滴度在初次免疫后1周即开始升高,第6周达到高,重构的重组HPV58 L1蛋白可诱导小鼠产生较高水平的中和抗体.结论 应用含铝佐剂的HPV58 L1 VLP免疫小鼠,具有较好的免疫学活性,可作为多价HPV疫苗的组分抗原.

人乳头瘤病毒31和33型L1蛋白类病毒颗粒的制备及其免疫原性

目的 采用汉逊酵母系统表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31和33型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs),纯化后检测其免疫原性.方法 将表达HPV31和HPV33 L1蛋白的重组汉逊酵母工程菌经高密度发酵,收集菌体,进行高压均质破碎后,采用亲和层析法纯化HPV31和HPV33 L1 VLPs,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白,透射电镜观察VLPs形态,动态光散射仪分析VLPs粒径大小及分布情况.将BALB/c小鼠随机分为3组:HPV31 L1 VLP组(蛋白含量0.5 μg,铝含量0.24 mg)、HPV33 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)和佐剂对照组(铝含量0.24 mg),分别于0、1、3周经腹腔注射免疫小鼠,于每次免疫后1周经眼球采血,分离血清,采用假病毒中和试验检测血清中和抗体滴度.结果 纯化的HPV31和HPV33 L1重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与HPV L1通用型单克隆抗体发生特异性结合.经透射电镜及动态光散射观察,可见VLPs形成,但部分L1蛋白以五聚体的壳粒形式存在,未包装成颗粒.HPV31和33 L1 VLPs初次免疫后1周,即能诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的血清中和抗体,且明显高于佐剂对照组(P＜0.05),随着免疫次数的增加,HPV31L1 VLP组和HPV33 L1 VLP组免疫小鼠血清中和抗体滴度也相应增加.结论 应用汉逊酵母可高效表达HPV31和HPV33 L1重组蛋白,并形成VLPS.用含铝佐剂的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,具有较好的免疫原性,可作为多价重组HPV疫苗的组分抗原.

皮卡重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的稳定性

目的 观察皮卡重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的稳定性.方法 将皮卡重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)分别于37、25和2-8℃放置不同时间,检测疫苗的体外相对效力(Relative potency,RP)、pH值和纯度的变化,观察其稳定性.结果 疫苗于37℃放置45 d,RP略有下降,但仍在合格范围内;25℃放置6个月,RP和pH值均无明显变化;2-8℃放置12个月,RP、pH值和纯度均无明显变化.结论 皮卡重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)稳定性良好.

学龄儿童10μg汉逊酵母重组乙肝疫苗加强免疫的效果及安全性评价

[目的]评价学龄儿童加强接种10μg汉逊酵母重组乙肝疫苗的安全性和免疫效果，为制定乙肝免疫预防策略提供依据。[方法]选取2101名学龄儿童作为安全性观察的研究对象，对所有对象接种3针10μg汉逊酵母重组乙肝疫苗，观察不良反应的发生率。同时，对其中404名儿童进行免疫效果观察，对比加强免疫前后抗体浓度及阳性率的变化。[结果] 2101名受试儿童中，共发生不良反应85例，发生率为4．05％，其中84例为轻度反应，1例为中度反应，无重度反应。疫苗接种后，人群保护性抗体的阳性率为100．00％，抗体浓度由接种前的2．55 IU／L上升为接种后的5051．90 IU／L，差异有统计学意义（Z＝12．51，P＝0．00）。[结论]汉逊酵母重组乙肝疫苗用于学龄儿童加强免疫具有良好的安全性，免疫效果良好。

基因重组(汉逊酵母)技术揭开乙型肝炎免疫预防新篇章

共同担起摘除"肝炎大国"帽子的重任

大连汉信(原大连高新)生物制药有限公司是专业从事人用疫苗研发及生产的高科技生物制药企业.公司围绕着先进的基因工程技术平台和病毒免疫等学科方向,先后承担了国家"863"重点攻关项目"重组(汉逊酵母)乙肝疫苗"、"重组戊肝疫苗";国家"九五"重点攻关项目"重组水蛭素"等的研发工作.

重组(汉逊酵母)乙型肝炎疫苗免疫效果分析

多年来,濮阳市乙型肝炎(乙肝)疫苗接种工作在各级得到普遍加强并取得良好的免疫效果,≤18岁人群HBsAg携带率由2001年的8.54%降至2006年的2.34%[1],表明乙肝疫苗的推广应用显著降低了全市人群的HBsAg携带率.