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日本医蛭的研究进展
日本医蛭是中国药典收载的唯一吸食动物血液的水蛭药材品种,具有极强的抗凝血酶活性和抗血小板聚集作用.现阶段对日本医蛭的研究十分匮乏,不利于日本医蛭资源繁育及开发利用.本研究综合国内外日本医蛭的研究现状进行了分析,并阐述了日本医蛭产业发展存在的问题,旨在为更好地保护利用中药材资源提供数据和参考.
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水提取法和仿生提取法研究水蛭不同炮制品的体外抗凝活性
为确定水蛭传统炮制的科学性,分别采用水提取法和仿生提取法提取水蛭清水吊干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的抗凝活性成分,以活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、抗凝血酶活性作为活性指标进行抗凝测定,并采用考马斯亮蓝法,测定各炮制品提取物中的蛋白含量以初步解释抗凝活性变化原因.对比发现,采用水提取法时,APTT,PT,TT,抗凝血酶活性4种指标结果均显示,滑石粉烫制或酒浸闷烘后水蛭的抗凝活性降低,活性顺序为清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品,此结果与水蛭不同炮制品水提物蛋白含量顺序一致;而采用仿生提取法时,除滑石粉烫制后APTT缩短外,其他结果均显示炮制使水蛭抗凝活性升高,且活性顺序为酒浸闷烘品>滑石粉烫制品>清水吊干品.仿生提取法与水提取法相比更符合水蛭口服后在人体内的吸收过程,结果更具科学性.所以,传统的炮制方法不仅可以矫味矫臭,还可增强水蛭的抗凝活性作用.
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十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1的原核表达及其抗凝活性研究
目的 分离、克隆十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1基因,在大肠埃希菌中重组表达AduNAP1,并检测其抗凝活性. 方法 以十二指肠钩虫成虫cDNA为模板,PCR扩增AduNAP1成熟肽编码序列,并克隆、连接到表达质粒pET32a-sumo,构建原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP1.重组载体转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.重组产物经Ni亲和层析后用SUMO蛋白酶酶切融合伴侣,纯化获得重组目的多肽.用 SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况,用凝血时间法(PT及aPTT)检测重组多肽的抗凝活性. 结果 扩增并克隆AduNAP1成熟肽编码序列,构建的原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP-1转化大肠埃希菌表达rAduNAP1.纯化的rAduNAP1能延长PT及aPTT,但延长PT作用更为显著,其延长2倍PT及aPTT时间所需的浓度分别约为142 nmol/L及406 nmol/L. 结论 构建rAduNAP1表达载体,其表达产物具有较强抗凝活性,为进一步了解AduNAP1的生物学功能及作为抗凝新药开发应用奠定了基础.
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凝血因子V基因突变与肺栓塞
肺栓塞的栓子主要来自下肢深部静脉或盆腔静脉。西方国家报道,静脉血栓栓塞性疾病的年发病率约1‰[1],肺栓塞发病率约40.9%。近年来,众多学者在静脉血栓形成机制,特别是在分子水平进行了研究,提出静脉血栓栓塞性疾病是由于遗传和/或环境异常造成的一种多基因、多因素疾病。其中,凝血因子V(Factor V,FV)基因突变是静脉血栓性疾病的重要危险因素并已成为血栓性疾病研究中的一个热点。 一、凝血因子V突变的概念 1993年瑞典科学家Dahlback[2]在对1例19岁的家族性静脉血栓患者的研究中发现,血浆中存在一种对活化蛋白C(Activated Protein C,APC)抗凝活性抵抗现象;经对患者家族成员进行研究,在部分成员得到了同样的结果;初步认为这种现象与遗传有关。1994年荷兰Leiden的科学家Bertina和Dahlback的实验室对活化蛋白C抗凝活性有抵抗现象(Activated Protein C Resistence,APC-R)患者的凝血因子V基因进行了分析,发现凝血因子V基因单个位点突变是APC-R的主要原因[3]。随后,亦有大量的研究证实了这一观点[4~6]。
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依据体重调整肝素用量简易表及标尺的设计与临床应用
肝素(heparin)用于治疗和预防血栓栓塞性疾病已有30多年的历史,其有效的抗凝作用及易于监测的特点备受临床青睐.但由于肝素抗凝活性的半衰期与剂量有关,且易于受到患者血小板与血管内皮功能等因素影响[1] ,故肝素的血浆稳态浓度较难把握[2].
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肝素小分子片段对平滑肌细胞生长及其抗凝作用的对比研究
肝素小分子片段抑制平滑肌细胞(SMC)增殖及抗凝作用的关系目前尚缺乏认识。本研究发现几种小肝素片段抗凝活性基本丢失,但均保持了抑制SMC增殖的活性。 1. 材料与方法:(1)肝素及其小分子片段对培养的人主动脉SMC的作用:将培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)接种于24孔培养板。每孔1 ml (1×104细胞),实验共分7组:第1~5组含有不同糖基数的肝素小分子片段,第 6组含大分子肝素,第7 组为对照组,不含肝素及肝素小分子片段。上述各组肝素的浓度均以糖醛酸表示,每组3个浓度(19、38、76 μg/ml)。用含 10%人血清,10%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h,然后用3[KG*2]HTdR参入法观察肝素及其小分子片段对培养的hASMC生长的影响。(2)肝素小分子片段抗凝活性的测定:用凝血法测定肝素及不同肝素小分子片段激活全血凝固时间。
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新型抗凝药物的研究展望
目前临床上常使用的抗凝药物包括普通肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)、华法林等,这些药物的临床价值已得到许多大型临床试验的证实而广泛应用于临床实践.而一系列新型静脉抗凝药物包括磺达肝癸钠(fondaparinux)、比伐卢定(bivalirudin)等凭借各自的特点,在欧美国家已经开始应用于动静脉系统血栓的防治[1].利伐沙班(Rivaroxaban)是一种新型口服抗凝药物,它们的抗凝活性不依赖抗凝血酶Ⅲ,可直接结合于Xa因子的活性部位而抑制Xa因子的抗凝活性,已完成的一些研究充分显示了利伐沙班在静脉系统血栓防治方面的巨大潜力,有望成为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism, VTE)防治的新标杆[2-4].正在进行的研究将进一步验证其在房颤及急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)方面的应用价值.
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薤中抗凝和抗癌活性成分的结构鉴定
从百合科葱属植物薤(Allium chinense)鳞茎的抗凝和抗癌活性部位中,分离得到了6个化合物.经过化学方法和光谱分析(IR,EI-MS,1HNMR,13CNMR,1H-1H COSY,HMBC,HMQC和NOESY谱),鉴定它们的结构分别为(25R,S)-5α-spirostane-3β-ol 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside} (1),(25R,S)-5α-spirostane-3β-ol 3-O-{β-D-glucopyranosyl (1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)](6-acetyl-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-β-D-galactopyranoside} (2),(25R,S)-5α-spirostane-2α,3β-diol 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside} (3),(25S)-24-O-β-D-glucopyranosyl-3β,24β-dihydroxy-5α-spirost-3-O-α-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (4),chinenoside II (5)及2,3,4,9-tetrahydro-1-methyl-1H-pyrido [3,4-b] indole-3-carboxylic acid (6).化合物4为一新的甾体皂甙,命名为chinenoside VI.化合物1~3为3对甾体皂甙差向异构体.其中,化合物2的25S型异构体为首次报道;25R型异构体和化合物6为首次从本种植物中分得.此外,通过NOESY谱还首次确定了化合物6的相对构型,并对其C和H信号进行了确切归属.
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低分子肝素相对分子质量与抗凝活性关系研究
目的:研究低分子肝素相对分子质量与抗凝活性之间的关系.方法:用生色底物法测定不同相对分子质量的低分子肝素6个分级和未分级样品的抗Xa因子和抗Ⅱa因子效价,相对分子质量采用高效体积排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)测定.结果:抗xa因子与抗Ⅱa因子效价比随着相对分子质量的降低而增大.结论:在测定范围内,低分子肝素相对分子质量降低,抗凝活性降低,抗栓作用增强.
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重组水蛭素抗栓及抗弥漫性血管内凝血作用的实验研究
水蛭素(hirudin)为中医活血化淤药水蛭的主要有效成分,系由65个氨基酸组成的单链多肽,是迄今作用强的特异性凝血酶抑制剂,具有很强的抗凝、抗栓活性,对多种血栓疾病具有预防和治疗效果.目前国内外采用基因重组技术研制水蛭素取得了令人瞩目的进展.重组水蛭素(recombinant hirudin,r-hirudin,rH)产品中仅变异体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ具有抗凝活性,简称HV1,HV2和HV3.国内有关单位采用甲基营养型汉逊酵母真核表达系统研制出的rH与天然水蛭素HV1不同之处除rH-63位酪氨酸脱硫酸基外,还有N末端为N-Ile1-Thr2型,这为国内外首创.本文研究了此种rH的抗动、静脉血栓及抗家兔急性弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)作用,旨在为水蛭素新药开发提供实验研究资料.
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水蛭注射液的研制
目的 探索不同方法提取水蛭的有效成分,创制新制剂水蛭注射液.方法 本文以凝血时间为指标对不同的提取方法进行比较,采用t检验进行分析,选择佳提取方案,尝试制备水蛭注射液.结果 (1)不同方法制得的水蛭注射液均有抗凝血作用,从经济角度考虑,本文采用生理盐水提取水蛭有效成分.(2)水蛭比蚂蝗、柳叶蚂蝗含有更高的抗凝成分.结论 选用水蛭为原材料,利用生理盐水提取水蛭有效成分,采用三冻三缓、过滤等步骤能制备水蛭注射液.
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蚓激酶的研究与临床应用
蚓激酶作为中药地龙(即蚯蚓)的主要抗凝、溶栓成分,经动物实验及临床观察证实具有良好的纤溶、抗凝、溶栓和改善血流变等药理作用,并取得了较理想的结果.与同类药物比较,蚓激酶具有不良反应小、安全性高、疗效较显著、生产成本低等优势.国内外的学者对蚓激酶进行了大量的研究,现就蚓激酶基本的理化性质、生化方面、作用机制、临床应用等的研究成果做一简要综述,总结其中存在的问题并对前景作出展望,以期能有助于今后对蚓激酶的进一步研究开发和利用.
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肝素在连续性血液净化治疗中对TF、TFPI及PAI-1的影响及机制研究
在血液净化过程中,抗凝是保证透析治疗效果的必需步骤.肝素抗凝是血液净化过程中常用的抗凝技术之一,普通肝素(UH)是通过与抗凝血酶(AT)结合,增强后者的抗凝活性而发挥间接抗凝作用[1],同时还抑制凝血因子(F)Ⅹa、FⅨa、FⅪa、FⅫa活性.有研究表明,在血液净化过程中,一次透析后血浆组织因子途径抑制物(TFPI)的升高幅度与透析过程中使用的肝素量呈直线相关[2-5].纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)作为调节纤溶平衡的重要因子,在血液净化过程中同样发挥着重要的调节作用.肝素在连续性血液净化(CBP)过程中影响凝血纤溶因子的机制尚无报道.我们通过观察CBP治疗多器官功能障碍综合征(MODS)患者过程中肝素对组织因子途径及纤溶因子的影响,并通过体外培养的血管内皮细胞探讨其机制.
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再生障碍性贫血患者TM、AT-Ⅲ、GMP-140测定分析
出血是再生障碍性贫血(再障)常见的症状,其出血机制是多因性的,血小板减少是引起再障出血的主要原因,但血小板减少机制除了生成减少外,有无破坏和消耗增加之机制参与不清楚。此外,抗凝活性异常在再障出血机制中的作用仅有少数报道[1~4]。为了进一步探讨血管因素、血小板和抗凝机制在再障出血中的作用,我们检测了血管内皮损伤的标志物血栓调节蛋白(TM)、血小板激活分子标志物血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)和抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)之血浆含量,并结合DIC实验检测做再障出血机制的进一步分析。现将检测结果报道如下。1 材料和方法1.1 对象再障患者45例,其中慢性再生障碍性贫血(慢再)36例,急性再生障碍性贫血(急再)9例。男25例,女20例,中位年龄29(10~58)岁。所有患者均根据临床症状、血象、骨髓象和有关实验确诊,诊断符合1987年宝鸡再障会议制订的标准[5]。正常对照30例,男18例,女12例,中位年龄31(12~60)岁。为本院健康职工和医学院学生,检测前均体格检查并1周内未服用阿司匹林或其他抗凝剂。
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第51讲不稳定性心绞痛和非Q波心肌梗死的诊治进展(2)
(上接第21期)3.2 抗凝药普通肝素(UH)对UA/NQMI患者是有益的,过去建议用于中、高危亚群,使用2~5天或至冠脉介入.但由于UH是不同链长的硫酸粘多糖的混合物,在不同个体量效关系是不同的,也就是说其抗凝活性不能预知,需监测aPTT,同时UH也能激活血小板聚集而致血栓形成,也可致血小板减少症,甚至有时是致命的,这就促使一些新的抗凝药的研制,主要包括LMWH和水蛭素.
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正交试验法优选心脑苏颗粒的水提工艺
目的:优选心脑苏颗粒水提工艺.方法:应用HPLC和正交试验,以心脑苏颗粒中活性成分丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛提出量、全方收膏率及抗凝活性的综合评分为考察指标,以提取时间、提取次数、加水量等3个因素设计L9(34)正交试验优选心脑苏颗粒水提工艺.结果:佳水提工艺为加8倍量水回流提取2次,每次1h.结论:优选的提取工艺稳定可靠,可用于心脑苏颗粒的生产制备.
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遗传性抗凝血酶缺陷症基因突变的研究进展
人体的抗凝系统主要有抗凝血酶(antithrombin,AT)系统(包括抗凝血酶和肝素,主要抑制具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子,如:FXa,凝血酶等)和蛋白 C 系统(包括蛋白 C,蛋白 S,血栓调节蛋白,内皮细胞蛋白 C 受体等,主要灭活凝血因子Ⅴ和Ⅷ等),而抗凝血酶系统中的抗凝血酶是人体重要的抗凝因子之一,约占抗凝活性的70%。抗凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶(serpins)抑制剂,主要具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的凝血酶、FXa 等因子,在人体抗凝系统中发挥着重要作用。
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水蛭素的应用及研究进展
水蛭素是一种单链环肽化合物,具有抗凝作用,本文介绍其作用机制及国内外利用生物工程技术制备水蛭素概况.
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蚂蟥中抗凝血活性组分的提取精制工艺研究
目的:对蚂蟥中抗凝血活性组分的提取、精制工艺进行优化.方法:以抗凝活性为指标,采用单因素及正交实验考察提取精制工艺.结果:佳工艺为蚂蟥药材用4倍量40%的丙酮常温浸渍提取4次,每次24 h,提取液浓缩后先用60%的乙醇除杂,再用85%的乙醇沉淀出活性组分,并真空干燥,whitnumin的提取率为0.072%.结论:该提取工艺方法简单、科学,有推广应用价值.
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慢性乙型肝炎患者血浆纤溶酶原激活物抑制物-1活性的检测及与肝纤维化的关系
纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是体内重要的纤溶活性调节剂,它与慢性肝病患者的纤溶抗凝活性、肝纤维化、肝细胞再生等病理过程密切相关[1].我们检测血浆PAI-1活性、血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、胶原蛋白(PCⅢ、Ⅳ-C)、透明质酸(HA)及层粘连蛋白(LN)水平,以期探讨慢性乙型肝炎(乙肝)患者血浆PAI-1活性的变化及与肝纤维化的关系.