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脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障功能的变化
目的 研究脓毒症对大鼠肠黏膜免疫屏障功能的影响.方法 60只SD大鼠随机(随机数字法)分为对照组(n=15)和脓毒症组(n=45),采用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症模型.模型建立后3 h、6 h和12 h留取回肠黏膜和全血标本.分别进行肠黏膜形态学观察、肠防御素5(RD-5)及肠三叶因子3(TFF_3)Mrna表达水平检测、肠黏膜淋巴细胞凋亡分析,以及外周血中肠源性细菌DNA定性检测.结果 CLP所致脓毒症导致大鼠回肠黏膜明显损害,主要表现为上皮脱落、固有层分离、毛细血管出血和溃疡形成;脓毒症组模型建立后3 h即出现RD-5和TFF_3 Mrna表达显著性减少(与正常组比较,P<0.05),且6 h和12 h组进行下降(与3 h组比较,P<0.05),肠黏膜淋巴细胞凋亡数亦显著增加(P<0.05);同时,脓毒症组全血肠源性细菌DNA扩增全部阳性.结论 脓毒症时大鼠肠黏膜免疫屏障功能显著减退,且随脓毒症的发展而进行性恶化.
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乌司他丁对脓毒症大鼠肠道防御素5 mRNA表达的影响
目的 探讨乌司他丁(ulinastatin,LTI)对脓毒症大鼠肠道潘氏细胞防御素5(rat defemin-5,RD-5)mRNA表达的影响.方法 实验在中山大学医学院药理实验室完成.60只SD大鼠随机分为对照组、脓毒症组、预处理组及治疗组(n=15).后三组采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation andpuncture,CLP)制作大鼠脓毒症模型.预处理组在CLP前2h经尾静脉注射UTI 25 000 U/kg,治疗组在CLP后2 h经尾静脉注射UTI 50 000 U/kg.于模犁建立后12 h取回肠黏膜,观察其病理改变并以RT-PCR法检测RD-5 mRNA的表达.数据以SPSS 13.0统计软件处理,采用方差分析及LSD-t检验进行数据分析.结果 RD-5 mRNA在脓毒症组显著下降(P<0.05),预处理组及治疗组较脓毒症组有明显升高(P<0.05),预处理组较治疗组明显升高(P<0.05).结论 脓毒症大鼠RD-5mRNA表达明显下降,乌司他丁可显著上调其表达,保护肠黏膜,预防用药较治疗给药可能更有意义.
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重组防御素5对铜绿假单胞菌的杀菌效应和抗粘附作用
目的:观察重组防御素5(rHD-5)对铜绿假单胞菌的杀菌/抑菌效果.方法:将冷存的rHD-5按照浓度稀释成100μg/ml(Ⅰ液)、200μg/ml(Ⅱ液)和300μg/ml(Ⅲ液),以不含rHD-5的磷酸盐缓冲液(O液)为对照,观察了它们对大肠杆菌标准株(ATCC25922)、铜绿假单胞菌标准株(ATCC27853)、铜绿假单胞菌野生株的杀菌效果,以及抗铜绿假单胞菌野生株对小肠上皮细胞(IEC-6)粘附的效果.结果:随着rHD-5浓度的逐渐增加,对大肠杆菌的抑菌坏直径也相应扩大,O液、Ⅱ液、Ⅲ液的抑菌坏直径分别为0mm、15.78±0.67mm、31.11±0.89、36.94±0.77mm;虽然对铜绿假单胞菌标准株的抑菌坏直径没有上述趋势,但Ⅲ液产生了抑菌环,直径为16.67±0.79mm,对铜绿假单胞菌野生株则无抑菌环产生.此外,O液、Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液干预铜绿假单胞菌野生株后,对IEC-6的平均粘附率分别为98.02%±0.51%、18.68%±1.49%、9.46%±2.74%、0.73%±0.44%,单个IEC-6细胞所粘附的细菌数分别为20.52±6.70、4.26±2.70、6.88±3.92和0.68±0.79,受损害的IEC-6所占百分比分别为30.88%±30.48%、8.36%±4.52%、2.94%±3.58%、0%,均呈剂量依赖性降低趋势.结论:rHD-5对铜绿假单胞菌的杀菌及抑菌作用,提示其在防治肠源性感染中具有潜在的临床应用价值.
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人源性空回肠粘膜防御素-5基因的克隆
目的克隆人防御素-5基因(HD-5 cDNA),构建其真核表达质粒载体.方法从人小肠粘膜中提取总RNA,并分离mRNA,经过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD-5 cDNA,并将其插入经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒载体pcDNA3.1(+)-HD-5 cDNA.结果经过限制性酶切鉴定和测序确定,HD-5 cDNA全长282bp,编码94个氨基酸,由编码信号肽、前片段和成熟肽的3部分序列组成.理论推导的氨基酸序列中,决定HD-5活性的6个半胱氨酸残基和2个保守的精氨酸残基处于正确的位置.结论成功获得了HD-5 cDNA,构建了含HD-5 cDNA的真核表达质粒载体,为研究重组HD-5的抗菌功能奠定了基础.
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人α防御素5(α-HD-5)基因真核表达产物体外抗菌活性的观察
[目的]为探索HD-5作为抗菌生物制剂替代传统抗生素的研究提供实验依据.[方法]构建毕赤酵母重组表达质粒pGAPZaA-HD5,转化毕赤酵母菌GS115,于Zeocin平板筛选阳性重组菌.振荡培养重组菌约48 h,离心取培养上清原液进行冷冻干燥,再稀释获得含有HD-5的原液(Ⅰ液)、5倍浓缩液(Ⅱ液)和10倍浓缩液(Ⅲ液),以不含HD-5的培养上清(0液)为对照,采用平板打孔药敏法,观察它们对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌环直径大小.[结果]随着HD-5浓度的逐渐增加,0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液对大肠埃希菌的抑菌环直径分别为0mm、(16.56±0.45)mm、(20.09±0.67)mm、(26.72 ±0.54)mm;对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径分别为0 mm、(11.45±0.13)mm、(18.09±0.32)mm、(25.50 ±0.21)mm;仅Ⅲ液对铜绿假单胞菌产生了抑菌环[(17.45±0.56)mm].[结论]体外实验证实HD-5的真核表达产物对革兰阳性和革兰阴性细菌有较显著的抑菌作用,提示其作为抗菌生物制剂替代传统抗生素具有潜在的临床应用价值.
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人小肠黏膜防御素5 mRNA的表达特点及意义
目的检测人小肠黏膜防御素5基因(Alpha defensin 5,DEFA5)的表达,为从分子水平上探讨小肠黏膜抗菌防御机制提供实验依据.方法从2例新鲜尸体和2例右半结肠癌患者的回肠部位取小肠黏膜提取总RNA,通过RT-PCR扩增出DEFA5的两个外显子序列,比较其个体间的差异;沿小肠轴间隔30 cm取新鲜尸体小肠黏膜提取总RNA,仍通过RT-PCR扩增编码HD-5的阅读框序列,比较HD-5沿肠轴的表达趋势.结果 DEFA5在个体间的表达是一致的,通过RT-PCR获得的外显子序列大小为451 bp,且碱基序列与GenBank中的DEFA5标准序列相一致;通过PCR获得的编码HI-5的阅读框序列为303bp,其中,酶切位点12bp,保护性碱基6bp,终止子3bp,编码HD-5的序列282bp(94AA);沿着空肠到回肠的肠轴方向,DEFA5在空回肠黏膜均有表达,至回肠末端强,并有逐渐增强的趋势.结论 DEFA5基因的表达在个体间是保守的,而且沿着空肠到回肠的肠轴方向在mRNA水平的表达有逐渐增加的趋势,提示HD-5作为天然免疫物质在小肠黏膜屏障功能的维护中起着十分重要的作用.此外,本实验获得的HI-5阅读框序列为进一步重组表达HD-5奠定了基础.
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阑尾黏膜防御素5 mRNA的表达及意义
阑尾参与了B淋巴细胞的产生和成熟过程,而且还可能通过分泌免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)参与了炎症防御[1],但对阑尾黏膜是否分泌诸如人防御素5(human defensin 5, HD-5)一类的天然免疫物质以参与抗炎过程尚无文献报道,本研究就此进行了初步探索,现报道如下.
