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诊断超声对HEK-293细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨诊断超声照射对体外培养的HEK-293细胞凋亡的影响.方法 采用HEK-293细胞,构建超声照射模型,采用4个超声照射剂量浓度(0 min、10 min、20 min和30 min),每个浓度设3个平行瓶,重复三次.处理后行Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪行凋亡细胞计数;免疫细胞化学检测Caspase-3凋亡蛋白表达水平的变化.结果 Annexin V-FITC/PI双染色显示,随着超声照射剂量的增加,流式计数的细胞凋亡率增加,20 min组具有统计学意义(P<0.05),30 min组具有显著统计学意义(P<0.01);同时可使凋亡蛋白酶Caspase-3表达水平增加.结论 特定剂量的超声聚焦照射可引起部分细胞凋亡改变,并具有一定量效关系.
关键词： 超声检查 凋亡 钙磷酯结合蛋白 荧光素-5-异硫氰酸盐 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 -
穿膜肽标记异硫氰酸荧光素及钆喷替酸葡甲胺行MR分子显像的探讨
目的选择穿膜肽的基本序列之一,构建目的多肽序列标记异硫氰酸荧光素(FITC)及钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA),探讨穿膜肽携带FITC及Gd-DTPA跨膜转运性能及MR分子显像的价值.方法在穿膜肽9聚精氨酸[arginine(9)]基础上,构建新目的多肽序列CPP13: LAGRRRRRRRRRK,固相合成多肽后标记FITC(记为CPP13-FITC)和Gd-DTPA(记为CPP13-DTPA-Gd);分别取CPP13-FITC和FITC 溶于无血清Dulbecco低必须培养液(DMEM)培养基中,待HEPG2细胞及鼠骨髓干细胞爬片上生长至80%～90%汇合时,取2只30 mm2皿,弃去培养皿中培养液,一皿中加入CPP13-FITC/DMEM溶液,另一皿中加入FITC/DMEM溶液,37℃ CO2孵箱中抚育10、30、60 min时依次取出1片, 磷酸平衡盐溶液(PBS)冲洗爬片后置于倒置荧光显微镜上观察细胞内出现荧光素分布的时间和部位.CPP13-DTPA-Gd作用肝癌细胞株HEPG2后,MRI研究CPP13-DTPA-Gd在细胞内转运性能及MRI的特点,将CPP13-DTPA-Gd 溶于无血清DMEM培养基中,浓度为3 mg/ml.待HEPG2细胞在100 mm2培养皿中长至80%～90%汇合时,取3只皿分别加入CPP13-DTPA-Gd的DMEM溶液、 DTPA-Gd/DMEM溶液和 DMEM溶液,孵育30 min 后弃去培养液,以0.1 M PBS反复冲洗,胰酶消化,加入2 ml 1%琼脂糖/PBS溶液混匀,装入2 ml离心管中,将3管固定于装有150 ml 1%琼脂糖/PBS溶液的微量加样枪头盒中,待凝固后测定MR信号.结果固相合成多肽成功,测定分子量为1792.78,与理论值接近.纯度达到95%以上;标记荧光素后,倒置荧光显微镜观察细胞摄取显示10 min时肝癌细胞株HEPG2和鼠骨髓干细胞胞质与细胞核内均出现荧光分布;CPP13标记的Gd-DTPA,作用细胞30 min后MRI显示CPP13-DTPA-Gd作用HEPG2细胞组呈短T1、短T2信号.3层面内3组细胞感兴趣区T1信号强度(Ii)与琼脂糖T1信号强度(Io)的比值及统计学分析如下:(1)号管3层面内Ii1/Io(为CPP-DTPA-Gd作用cell组管内信号值与管外烧杯内琼脂糖背景信号值的比值)分别为:2.84、2.60、2.48;(2)号管3层面内Ii2/Io(为Gd-DTPA作用cell组管内信号值与管外烧杯内琼脂糖背景信号值的比值)分别为1.15、1.11、1.12;(3)号管3层面内Ii3/Io(为空白cell对照组管内信号值与管外烧杯内琼脂糖背景信号值的比值)分别为1.13、1.11、1.11.两两组间F检验:(1)与(2):F(1,2)=201.88(P<0.001);(1)与(3):F(1,3)=206.37(P<0.001);(2)与(3): F(2,3)=0.529(P=0.507).说明T1WI信号强度与Gd-DTPA作用组及与单纯细胞组信号强度比较差异有统计学意义;HEPG2细胞不摄取Gd- DTPA,30 min时信号强度与单纯细胞组信号强度间差异无统计学意义.结论在穿膜肽基本序列基础上成功地重新构建的多肽能够携带荧光素和MR对比剂,并有效地跨膜转运进入细胞,为MR分子显像提供了1种新的重要手段.
关键词： 肽类 磁共振成像 分子显像 造影剂 荧光素-5-异硫氰酸盐 -
异硫氰酸荧光素标记膀胱癌靶向肽NYZL1的体外特异性鉴定
目的 探讨膀胱癌靶向肽NYZL1的特异性,为其临床应用提供理论基础.方法 ①采用固相化学合成法制备多肽及其异硫氰酸荧光素(FITC)连接肽,噻唑蓝(MTT)鉴定其细胞毒性.②采用免疫荧光技术检测FITC-NYZL1与人膀胱癌组织结合的特异性,以FITC-svNYZL1作阴性对照.③应用扫描激光共聚焦显微镜检测FITC-NYZL1与膀胱癌BIU-87、T24、E-J、5637细胞和肾癌KC细胞结合的特异性,以FITC-svNYZL1作阴性对照.结果 ①成功制备了实验所需的化学合成肽,高效液相色谱纯化和质谱检测结果显示其纯度高达98％,MTT结果表明化学合成肽对BIU-87细胞的增殖无影响.②FITC-NYZL1标记的膀胱癌组织出现了荧光富集,而其他组织未见荧光富集,FITC-svNYZL1标记的各组织均未见荧光富集.③与对照组相比,FITC-NYZL1在膀胱癌细胞上均有荧光富集,且不同膀胱癌细胞间平均荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 多肽NYZL1与膀胱癌组织、细胞均能特异结合,具有显著的结合特异性,为膀胱癌的早期诊断和靶向治疗提供了新的可能.
关键词： 膀胱肿瘤 荧光素-5-异硫氰酸盐 抗体特异性 NYZL1 -
两种变应原致小鼠变应性接触性皮炎的研究
目的建立两种变应性接触性皮炎(ACD)小鼠模型,并探讨其机制.方法分别以二硝基氟苯和荧光素-5-异硫氰酸盐作为致敏剂,以腹部致敏、耳部激发的方法建立两种ACD小鼠模型.激发前后测量耳廓厚度,计算耳肿胀度;H-E染色观察耳组织病理改变.用免疫组化法检测局部皮损中及用ELISA法检测淋巴结细胞分泌的Thl型/Th2型细胞因子水平.结果①成功建立两种ACD小鼠模型.②两种模型的局部皮损中细胞因子的表达有差异.二硝基氟苯组以白介素2表达为主;异硫氰酸荧光素组以白介素4表达为主.③二硝基氟苯组淋巴结细胞分泌干扰素γ的量是异硫氰酸荧光素组的5倍多;异硫氰酸荧光素组淋巴结细胞分泌白介素4的量是二硝基氟苯组的约2倍.结论二硝基氟苯诱导以Th1型细胞因子占优势的ACD,异硫氰酸荧光素诱导以Th2型细胞因子占优势的ACD.
