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抑制ERK1途径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响
目的 探讨抑制ERK1 传导路径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)合成的影响.方法 用4-羟基壬烯醛(4-HNE)做刺激原,分为10 μmol/L 4-HNE、50 μmol/L PD98059(MEK1 抑制剂)孵育+10 μmol/L 4-HNE、正常对照组分别作用支气管上皮细胞0.5、2、4、8、12 h 后,检测细胞γ-GCS mRNA 和蛋白的表达水平;10 μmol/L 4-HNE 刺激细胞0.5、2、4、8、12 h 后,检测磷酸化JNK、P38MAPK、ERK1/2、活化蛋白-1(AP-1)活性;观察MEK1 抑制剂PD98039 对AP-1 结合活性的影响.结果 10 μmol/L 4-HNE、50 μmol/L PD98059 孵育+10 μmol/L 4-HNE、正常对照组2、4、8、12 h,细胞γ-GCS 和γ-GCS mRNA 表达三组差异有统计学意义,50 μmol/L PD98059 孵育+10 μmol/L4-HNE 较其他两组增加.10 μmol/L 4-HNE 刺激0.5、2、4、8、12 h 组细胞磷酸化ERK1/2 水平,AP-1结合活性较对照组增强.PD98059 孵育后,4-HNE 作用0.5、2、4、8、12 h 后,AP-1 结合活性较未用PD98059 孵育4-HNE 刺激组降低.结论 MEK1 抑制剂PD98059 可以抑制支气管上皮细胞16-HBE细胞内ERK1-AP1 信号传导通路,对4-HNE 引起支气管上皮细胞γ-GCS 合成有促进作用,阻断AP-1途径后支气管上皮细胞并不能减少γ-GCS 的表达.
关键词： 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 4-羟基壬烯醛 活化蛋白-1 -
大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响
目的观察大鼠肺泡上皮细胞(CCL-149细胞系)谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)等表达变化,了解大蒜素对CCL-149细胞抗氧化能力的影响.方法在以四甲基偶氮唑盐(MTT)法确定大蒜素适当作用浓度的基础上,用不同浓度大蒜素(0、0.1、1.0、5.0μg/ml)作用CCL-149不同时间(6、12、24、48 h),用分光光度法检测细胞内GSH、MDA的变化;用Western blot法检测细胞内γ-GCS蛋白的表达,分析不同处理剂量、不同处理时间大蒜素对细胞内GSH、MDA及γ-GCS的影响.结果 (1)大蒜素浓度≤5μg/ml不影响细胞活力.(2)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在处理6 h后细胞内GSH含量[6 h组GSH含量分别为(16.45±0.69)、(16.81±0.79)、(17.80±1.10)mg/g蛋白]较对照组[(13.38±1.16)mg/g蛋白]显著增加(t=3.92～4.78,P均＜0.05),MDA含量[(1.07±0.02)、(1.02±0.06)、(1.00±0.05)nmol/mg蛋白]较对照组[(1.23±0.05)nmol/mg蛋白]下降(t=5.75～6.34,P均＜0.05).细胞内GSH水平升高至24 h达顶峰,48 h有所下降,仍较对照组高,相同时间点不同大蒜素浓度组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.05).(3)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在刺激6、12、24 h细胞内γ-GCS蛋白表达(24h为0.693±0.027、0.646±0.081、0.667±0.077)较对照组(0.531±0.007)显著增强(t=2.82～9.92,P＜0.05),各观察指标未呈现剂量依赖性.结论大蒜素能增强大鼠肺泡上皮细胞的抗氧化作用,可能与其促进γ-GCS的表达有关.
关键词： 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 谷胱甘肽 丙二醛 大蒜素 大鼠肺泡上皮细胞 -
脑缺血预处理对大鼠缺血再灌注损伤后抗氧化应激通路的影响
目的 研究脑缺血预处理(CIPC)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用并观察CIPC对核因子E2相关因子2(Nrf2)/γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)信号通路的影响.方法 180只雄性SD大鼠,随机分成3组:假手术组、模型组、CIPC组,每组分别在术后6、12、24、48、72h5个时间点进行神经功能评分后断头处死大鼠,并进行免疫组织化学染色,同时测定大脑皮质Nrf2、γ-GCS mRNA表达和脑组织谷胱甘肽(GSH)含量.结果 模型组和CIPC 组各时间点的行为学评分明显高于假手术组(P＜0.01).CIPC组缺血再灌注24、48和72 h的行为学评分明显低于模型组[(2.00±0.63)分vs (2.83±0.41)分、(2.16±0.41)分vs (2.83±0.41)分和(1.17±0.41)分vs(2.00±0.89)分,P＜0.05,P＜0.01].模型组与CIPC组各时间点Nrf2核转移的阳性细胞、Nrf2及y-GCS mRNA表达明显高于假手术组,GSH含量明显低于假手术组,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).CIPC组各时间点Nrf2核转移的阳性细胞、Nrf2及γGCS mRNA的表达、GSH含量明显高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论CIPC通过Nrf2/γ-GCS信号通路,调节下游抗氧化应激产物的表达,保护脑缺血再灌注引起的脑组织损伤.
关键词： 脑缺血 缺血预处理 再灌注损伤 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 NF-E2相关因子2 -
γ-GCS基因抑制元件E-box的实验研究
目的明确大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位编码基因(GCLC基因)负调控区域(-745～-705)上的功能元件E-box作用.方法利用迁移率变动试验(EMSA)和超级迁移率变动试验证实大鼠肺泡上皮细胞GCLC基因负调控区域的E-box元件能与转录因子USF1/USF2特异性的结合;通过共转染USF1/USF2表达质粒(pCMV-USF1/ pCMV-USF2)和GCLC-luc确认E-box元件在基因调控中的作用;后通过构建USF1/USF2的逆转录病毒载体,将表达USF1/USF2的重组逆转录病毒感染肺泡上皮细胞, 用Western印迹检测细胞GCLC蛋白表达受影响的情况,进一步确定E-box元件与USF作用在GCLC基因表达中的终作用.结果 EMSA和超级迁移率变动试验证实GCLC基因负调控区域的功能元件是E-box,且该元件与USF特异结合参与GCLC基因的调控;共转染USF1/USF2表达质粒的细胞GCLC基因表达明显下降;Western印迹证实感染重组USF1/USF2逆转录病毒使肺泡上皮细胞的GCLC蛋白表达明显下降.结论 E-box元件通过与转录因子USF作用抑制GCLC基因表达,E-box元件是γ-GCS基因的重要的抑制元件.
关键词： 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 反应元件 -
溴氰菊酯对大鼠脑组织某些抗氧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和NF-E2相关因子2基因表达的影响
目的研究溴氰菊酯(DM)对大鼠大脑皮层和海马组织铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、谷胱苷肽还原酶(GR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)轻亚单位(GCSl)重亚单位(GCSh)基因和红系核因子2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)基因表达的影响.方法将18只大鼠随机分为3组,每组6只,对照组腹腔注射橄榄油,低剂量DM染毒组(3.125 mg/kg体重)和高剂量DM染毒组(12.500mg/kg体重)大鼠染毒5 d.分别用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定CuZn-SOD、GR、GCSl、GCSh和Nrf2基因mRNA表达的相对量.12只大鼠随机分为3组,用免疫组织化学方法检测海马和大脑皮层中γ-GCS重亚单位蛋白(GCS-HS)和Nrf2蛋白水平.结果DM染毒大鼠大脑皮层和海马组织中的CuZn-SOD、GR、GCSh和Nrf2基因mRNA水平均未见明显改变;12.500mg/kg组大脑皮层、3.125 mg/kg组大脑皮层和海马组织中的GCSl基因mRNA水平低于对照组中各相应组织的水平,分别降低至对照组mRNA水平的71.1%、63.6%和75.2%,差异均有统计学意义(P＜0.01);DM染毒的大鼠海马CA1、CA2、CA3、齿状回和大脑皮层中的GCS-HS和Nrf2蛋白水平均未见明显改变.结论DM对GR及CuZn-SOD基因mRNA表达未见影响;DM抑制大鼠海马和脑皮层中GCSl基因mRNA表达,而未见影响GCSh基因mRNA的表达;本实验条件下DM对大脑皮层和海马组织中的Nrf2表达无明显影响.
关键词： 溴氰菊酯 基因表达 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 逆转录聚合酶链式反应 -
同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的抑制作用
目的:探讨同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的影响及其发生的可能原因.方法:实验于2004-08/2005-02在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室进行.选用健康家兔20只,取抗凝血,离心收集红细胞,制备含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶体系的红细胞裂解液,设置对照组,高、低剂量同型半胱氨酸处理组,每组均设8个平行管.各组均加入100mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH 8.0)60 μL,1 mol/L MgCl2 8 μL,10 mmol/L ATP 40μL,50 mmol/L谷氨酸(调pH为中性)40 μL,红细胞裂解液40μL.低、高浓度同型半胱氨酸处理组再分别加入100 mmol/L同型半胱氨酸20μL和60μL,其余实验条件相同.以反应中生成无机磷的mmol数表示γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性大小.分别用紫外分光光度法和荧光法检测各组无机磷和谷胱甘肽含量.结果:[1]无机磷的生成量:低浓度同型半胱氨酸组和高浓度同型半胱氨酸组明显低于对照组[(1.476±0.240),(0.751±0.085),(3.279±0.470)mmol/L,P＜0.01],高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组(P＜0.05).[2]还原型谷胱甘肽含量:低同型半胱氨酸组和高同型半胱氨酸组明显低于对照组[(3.058±0.264),(1.908±0.301),(4.476±0.462)μmol/L,＜0.01],高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组(P＜0.01).结论:同型半胱氨酸有可能通过竞争性抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性,减少细胞内还原型谷胱甘肽的生成.
关键词： 半胱氨酸 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 谷胱甘肽 -
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中的表达
背景:溃疡性结肠炎(UC)的黏膜损伤与氧化应激相关.谷胱甘肽(GSH)是细胞内重要的抗氧化剂,γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是其合成的关键酶.目的:探讨UC患者结肠黏膜中γ-GCS表达.方法:选取2007年8月～2009年12月北京军区总医院的30例UC患者,以26例健康者作为对照,应用免疫组化法检测结肠黏膜中γ-GCS的表达.结果:γ-GCS主要表达于腺体细胞胞质内,UC组γ-GCS表达显著低于对照组(53.3%对92.3%,P＜0.01).结论:UC患者结肠黏膜中γ-GCS表达显著降低,说明其存在氧化应激失衡,且GSH合成减少可能与γ-GCS低表达有关.
关键词： 结肠炎 溃疡性 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 免疫组织化学 -
左卡尼汀对肾脏缺血再灌注损伤中Nrf2和γ-GCS表达影响
目的 研究左卡尼汀对大鼠肾脏缺血再灌注损伤中核因子相关因子2(Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的影响.方法 将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组及治疗组.缺血再灌注组及治疗组建立肾脏缺血再灌注损伤模型,治疗组在缺血再灌注损伤模型建立前后尾静脉注射左卡尼汀2 mL.假手术组不行缺血再灌注处理.再灌注6h后处死大鼠,取血检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及胱抑素C(Cys C)的水平,并测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量.应用RT-PCR及Western-blot方法检测肾组织中Nrf2和γ-GCS的表达水平.结果 治疗组Cr、BUN、Cys C及MDA水平显著低于缺血再灌注组,SOD活性显著高于缺血再灌注组(F=8.58～57.42,q=4.06～11.26,P＜0.05);与假手术组相比,缺血再灌注组肾组织中Nrf2、γ-GCS mRNA及蛋白表达水平显著升高,而治疗组肾组织中上述指标较缺血再灌注组显著增高(F=143.53～241.64,q=3.76～13.51,P＜0.05).结论 左卡尼汀可减轻肾脏缺血再灌注损伤,其机制可能为通过激活Nrf2-ARE通路进而诱导γ-GCS的表达而实现的.
关键词： 再灌注损伤 左卡尼汀 NF-E2相关因子2 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 -
普罗布考对高糖培养人视网膜Müller细胞特化蛋白1/细胞骨架相关蛋白/核因子E2相关因子2/半胱氨酸连接酶催化亚基表达的影响
目的 观察普罗布考对高糖环境下人视网膜Müller细胞中特化蛋白1(SP1)/细胞骨架相关蛋白(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)表达的影响;初步探讨普罗布考的抗氧化作用.方法 体外培养的人Müller胞分为正常糖组(5.5 mmol/L)、高糖组(25.0 mmol/L)、正常糖+普罗布考组、高糖+普罗布考组;后两组中加入100 μmol/L普罗布考.免疫荧光染色法鉴定Müller细胞;免疫荧光染色法和实时RP-PCR(qRT-PCR)检测各组Müller细胞中SP1、Keapl、Nrf2、GCLC蛋白、mRNA的表达.两组间数据比较采用独立样本t检验.结果 体外培养的人Müller细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性率＞95％.免疫荧光染色结果显示,Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC蛋白均呈阳性表达.qRT-PCR结果显示,与正常糖组比较,高糖组Müller细胞中SP1(t=28.30,P＜0.000)、Keap1(t=5.369,P=0.006)、Nrf2(t=10.59,P=0.001)mRNA表达显著上调,GCLC显著下调(t=4.633,P=0.010),差异均有统计学意义.与高糖组比较,高糖+普罗布考组Müller细胞中SP1(t=12.60,P=0.000)、Keap1(t=4.076,P=0.015)mRNA表达显著下调,Nrf2(t=12.90,P=0.000)、GCLC(t=15.96,P＜0.000)mRNA表达显著上调,差异均有统计学意义.结论 普罗布考通过抑制高糖诱导Müller细胞中SP1、Keapl的表达,上调Müller细胞中Nrf2、GCLC的表达,发挥抗氧化作用.
