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NOR1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响
目的 NOR1基因真核表达载体pcDNA3.1(+)的构建并了解其对肝癌细胞系HepG2生长的影响.方法将NOR1cDNA亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,并把重组质粒pcDNA3.1(+)/NOR1经脂质体转染至HepG2细胞中,运用MTT法、台盼蓝排斥等试验、流式细胞仪等分析NOR1基因对肝癌细胞HepG2生物学活性的影响.结果成功构建了NOR1基因真核表达体pcDNA3.1(+)/NOR1,经pcDNA3.1(+)/NOR1转染后的HepG2细胞生长速度明显抑制(P<0.05),且细胞从G0/G1期进入S期明显延缓.结论重组质粒pcDNA3.1(+)/NOR1能在HepG2细胞内表达,且能影响HepG2细胞的生长.
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NOR1基因对HepG2细胞白介素-8水平的影响
目的探讨NOR1基因对HepG2细胞IL-8水平的影响.方法将NOR1基因通过脂质体转染入HepG2细胞后,抽提细胞总RNA,运用RT-PCR检测IL-8mRNA的水平,用ELISA检测细胞培养上清液IL-8的表达水平.结果细胞培养上清液IL-8蛋白水平,转染NOR1基因组明显高于空白组和对照组(P＜0.01);而转染NOR1基因组与转染空质粒组IL-8mRNA的表达水平无显著差异(P＞0.05);结论 NOR1基因诱导HepG2细胞IL-8蛋白水平表达增高.
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NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响及机制探讨
目的 探讨NOR1基因对HepG2细胞E-选择素表达水平的影响及NF-kB通路是否参与了NOR1基因对HepG2的E-选择素的影响.方法 将NOR1基因通过脂质体转染入HepG2细胞.分别设立HepG2细胞对照组、HepG2/ pcDNA3.1(+)空白质粒细胞组、HepG2/ pcDNA3.1(+)/NOR1转染阳性克隆细胞组、PDTC处理的HepG2/ pcDNA3.1(+)/NOR1转染阳性克隆细胞组(后简称PDTC处理组),分别检测4组细胞E-选择素的mRNA水平和蛋白水平.结果 基因芯片筛选转染NOR1基因的HepG2细胞E-选择素表达水平上调(cy3/cy5>2.0);RT-PCR结果显示转染阳性克隆细胞组E-选择素mRNA的表达水平明显高于空白组、对照组和PDTC处理组(P＜0.01),ELISA结果显示转染阳性克隆细胞组E-选择素表达水平明显高于空白组、对照组和PDTC处理组 (P＜0.01).结论 NOR1基因诱导HepG2细胞E-选择素表达水平增高,NF-kB通路参与了NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响.
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应用基因芯片技术筛选转染NOR1基因后HepG2细胞差异表达基因
目的 研究转染NOR1基因后肝癌细胞系HepG2基因表达谱的改变.方法 应用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(+)/NOR1真核表达载体和pcDNA3.1(+)空白载体分别转染入肝癌细胞系HepG2,再分别提取转染pcD-NA3.1(+)/NOR1和空载体pcDNA3.1(+)的HepG2细胞总RNA,应用基因芯片技术进行芯片分析.结果 芯片分析结果显示差异表达基因中上调的基因有59个,下调的基因有103个,这些差异基因的功能涉及多个方面.结论 应用基因芯片技术成功筛选了NOR1基因转染细胞后差异表达基因,为阐明NOR1基因与肝癌发生发展的关系提供了实验依据.
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新克隆的硝基还原酶基因NOR1的表达及其产物的纯化
背景与目的:NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤/易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白.方法:抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT-PCR扩增NOR1基因全长,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后插入同样经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-thiogalactoside,IPTG)诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Westernblot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化.结果:酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Westernblot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白.结论:成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础.
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新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响
目的:研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响.方法:将pcDNA3.1(+)/ NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG2 细胞,Northern blot筛选出阳性克隆,通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定.结果:鉴定出6种表达上调的蛋白质点,包括锌指蛋白、肿瘤坏死因子受体、酪氨酸蛋白磷酸化受体等,这些蛋白质涉及基因转录、信号转导等肿瘤发生相关事件.结论:NOR1基因可能通过上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展.
关键词： NOR1基因 双向电泳 基质辅助激光解吸飞行时间质谱
