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发根聚合酶链反应诊断急性间歇性卟啉症
急性间歇性卟啉症(acute intermittent porphyria, AIP)是常染色体显性遗传病.患者肝和红细胞中胆色素原脱氨酶(PBG-DA)缺乏,尿中大量胆色素原(PBG)和δ氨基γ酮戊酸(ALA)排出.目前该病主要以生化方法检查.笔者采用发根聚合酶链反应(PCR)结合内切酶分析检测AIP基因,行基因诊断,效果理想.
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以反复腹痛为主要临床表现的急性间歇性卟啉病1例及文献复习
急性间歇性卟啉病是因血红素合成路径中第3个酶胆色素原脱氨酶(porphobilinogen deaminase,PBGD),也称为羟甲基胆素合成酶(hydroxymethylbilane synthase,HMBS)的缺乏导致卟啉类化合物代谢紊乱而发生的一种常染色体显性遗传疾病.中南大学湘雅二医院于2015-10诊治了1例以反复腹痛2年为主诉的女性.通过基因测序发现患者MBS基因3号外显子的3782位点胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T的杂合无义突变,从而导致氨基酸结构由谷氨酰胺变为终止密码(Q34*).此突变通过降低PBGD的活性导致疾病的发生.
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卟啉病相关胆色素原脱氨酶基因的克隆与原核表达
目的 主要为了获得胆色素原脱氨酶(PBGD)在大肠杆菌中的原核重组表达蛋白,并对其进行纯化,为下一步研究PBGD结构及功能提供实验基础.方法 以人细胞中的总lRNA逆转录得到的cDNA为模板,PCR扩增,构建pET28a(+)-PBGD重组质粒.把含有外源片段的pET28a-PBGD重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,经His纯化方法获得高纯度的PBGD融合蛋白.结果 PCR扩增出大小约1 500 bp的特异PBGD cDNA片段;成功构建了pET28a(+)-PBGD融合表达载体;该表达载体融合表达的蛋白分子量约为44 kD,且大部分纯化蛋白存在于包涵体中.胆色素原脱氨酶的酶活性检测中发现,PBGD的适酶反应温度为36℃,适酶反应pH为7.5.结论 该实验已成功地克隆出编码正确的PBGD基因片段,并构建了高效原核融合表达载体:pET28a(+)-PBGD.获得PBGD在大肠杆菌中表达的重组蛋白,并纯化至均一,为PBGD结构和功能的研究提供基础.