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P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达调控
目的:研究P21对POLD1基因的调控通路,以探索阻断癌细胞恶性增殖的机制.方法:实验主要分3组:阴性对照组(转染空载体pXJ41-neo的803-pXJ细胞）、空白对照组(胃癌细胞MGC-803)、实验组（转染P21重组真核表达质粒pX J41 -p21的803-p21细胞）.MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平的变化,Western blot分析蛋白表达差异.结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞增殖受到明显抑制,凋亡率(％)增高（11.36±0.51 vs 7.39±0.17,7.69±0.47,F=85.338,均P＜0.05）.实验组P21 mRNA表达水平显著提高(2.15±0.23 vs 1.05±0.11,1.00±0.00,F=59.054,均P＜0.05),POLD1则显著下调(0.45±0.07 vs 1.09±0.13,1.00±0.00,F=49.907,均P＜0.05); P21、P125蛋白表达变化与基因变化相一致.cyclin E、Rbl基因表达均上调,CDK2基因表达下调,c-myc基因表达则变化不大.结论:P21抑制了胃癌细胞的增殖、促进其凋亡,同时抑制了POLD1基因的表达,这种抑制作用可能通过CDK2、cyclin E、Rb1等细胞周期因子实现.
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人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控
目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行PCR扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-Cl质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析；转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-Cl组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化:实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLDl及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的CDK4蛋白；SMMC-7721细胞中突变型的CDK4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变；与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08 vs 0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P＜0.05)；实验组CDK4 mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11 vs 1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P＜0.01),POLD1 mRNA相应地升高(2.47±0.25 vs 1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P＜0.01)；稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03 vs 0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P＜0.05),P125(0.54±0.04 vs 0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P＜0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.
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反义RNA技术对抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因表达的研究
目的:应用反义RNA技术抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的表达,探索采用该技术干预肝癌的可行性.方法:制备人POLD1基因的反义RNA表达质粒,同时建立空白对照组与阴性对照组,由此将实验分为阴性对照组(转染空载体的SMMC-7721细胞)、空白对照组(肝癌细胞SMMC-7721)和实验组(转染人POLD1基因反义RNA表达质粒的肝癌SMMC-7721细胞)3组.MTT实验分析细胞增殖变化,并在转染SMMC-7721细胞48 h后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测POLD1基因的表达.结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,转染了反义RNA的实验组细胞增殖受到明显抑制.在转染后24～72 h,实验组吸光度24 h为0.306 7±0.015 4,48 h为0.459 2±0.033 2,72 h为0.567 1±0.061 1,与空白和阴性对照组相比,P值均＜0.05.实时荧光定量PCR实验显示,实验组POLD1的mRNA表达明显下调为0.142 5±0.020 5,阴性对照组为1.017±0.188,空白对照组为1.00±0.00(F=26.5,P＜0.05),说明POLD1基因表达受抑制.蛋白质印迹实验显示,POLD1基因蛋白水平(p125)变化趋势与mRNA相同,均为下调,其中实验组为0.222 3±0.009 7,阴性对照组为0.237 9±0.005 9,空白对照组为0.235 4±0.003 4(F=1 365.754,P值均＜0.05),说明反义RNA可抑制p125蛋白表达,结论与基因水平趋势一致.结论:针对POLD1基因设计的反义RNA体外抑制了肝癌细胞SMMC-7721的增殖,这与POLD1在基因和蛋白水平的表达下调有关.
