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抗TNFα单链抗体复制缺陷型腺病毒载体的构建及表达
目的:构建pAd/CMV/V5-DEST-TNFα-scFv重组腺病毒载体,通过病毒包装、纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并对TNFα-scFv进行表达、鉴定.方法:以携带TNFα-scFv基因的载体PUC57Amp为模板,扩增TNFα-scFv目的基因,构建穿梭质粒pDONR221-TNFα-scFv,测序证实质粒含有目的基因.与骨架质粒pAd-CMV-V5-DEST腺病毒骨架载体进行同源重组,形成表达克隆pAd/CMV/V5-DEST-TNFα-scFv.表达克隆转染293细胞,包装重组腺病毒,并鉴定和病毒滴定.结果:TNFα-scFv基因成功克隆到腺病毒载体中,转染293细胞后成功包装出重组腺病毒,病毒滴度为2.5×1011 TCID 50/mL,Western blot检测到TNFα-scFv基因在293细胞中高水平表达.结论:成功构建了带有TNFα-scFv基因的重组腺病毒载体,为进一步研究提供实验基础.
关键词： 肿瘤坏死因子α 抗TNFα单链抗体 复制缺陷型腺病毒载体 -
γ干扰素转基因表达对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用
目的探讨小鼠γ干扰素 (mIFN-γ) 在肺内局部转基因表达对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用.方法 6～8周龄雄性ICR小鼠,模型组第0天经鼻滴入BLM 3 mg/kg建立肺间质纤维化模型,预防治疗组于滴入BLM前48 h经鼻给予重组复制缺陷型mIFN-γ腺病毒 (AdCMVmIFN-γ) 5×108空斑形成单位(pfu)/鼠,治疗组于滴入BLM 后72 h经鼻给予等量AdCMVmIFN-γ,同时设立无外源活性基因的复制缺陷型腺病毒 (AdCMVNull) 对照组和生理盐水阴性对照组.第0、7、14天分别测小鼠体重,第14天收获其支气管肺泡灌洗液 (BALF) 和肺组织,右肺行苏木精-伊红(HE)和Masson三色染色,左肺经酸解法检测肺组织羟脯氨酸 (HYP) 含量.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF中mIFN-γ的浓度.结果 AdCMVmIFN-γ转基因预防治疗组和治疗组BALF中mIFN-γ含量明显增高[(21 250±6 497) pg/ml,(21 000±5 451) pg/ml],其它组BALF中mIFN-γ浓度为接近零水平.上述两组与其余各组比较,小鼠体重明显减轻(P<0.05),肺泡炎、纤维化程度均有加重倾向(P=0.07),肺HYP含量增高 (P<0.05). 结论 (1) AdCMVmIFN-γ经鼻滴入可在小鼠肺内实现mIFN-γ转基因表达;(2) 在BLM模型中,早期mIFN-γ转基因表达可在某种程度上加重BLM诱导的肺泡炎及肺纤维化程度.
关键词： 肺纤维化 博莱霉素 干扰素Ⅱ型 复制缺陷型腺病毒载体 -
负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定
目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-hpa).方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315-hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Ad-hpa,并大量扩增,收集纯化.对纯化后的Ad-hpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml.电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制.PCR双引物鉴定Ad-hpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段.结论成功包装了负盘.
关键词： 肝素酶 腺病毒科 复制缺陷型腺病毒载体 转染 -
腺病毒载体介导人KDR胞外段诱导抗小鼠肝癌的免疫效应
目的: 探讨复制缺陷型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hVEGFR-2或hKDR)胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果.方法:构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7 d后取脾细胞作为效应细胞(E),Hepa 1-6/mKDR作为靶细胞(T),行乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测特异性CTL杀伤活性;给免疫小鼠接种肝癌细胞Hepa 1-6,观察荷瘤小鼠成活情况.结果:Ad hKDRE免疫小鼠1周后,在E:T为100:1、50:1和25:1时,Ad hKDRE诱导的6 h CTL杀伤率分别为(81.5±5.6)%、(68.4±5.5)%和(39.6±3.9)%.Ad hKDRE免疫小鼠1周后接种2×106 Hepa1-6肝癌细胞,观察2个月无小鼠成瘤;接种5×106 Hepa1-6细胞,小鼠无瘤成活率为60%.上述CTL效应和抗成瘤作用在清除CD8+和CD4+ T淋巴细胞后消失.结论:Ad介导异种(人)KDR胞外段能有效地打破小鼠肝癌的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD4+和CD8+ T细胞依赖性的.
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重组腺病毒介导绿色荧光蛋白基因对小鼠眼组织的转染和表达
目的 研究不同剂量Ad5-EGFP前房注射后,报告基因在小鼠眼部组织的表达情况及分布特点.方法 24只BALB/c小鼠随机分组.实验组以不同浓度梯度前房注射Ad5-EGFP.对照组前房分别注射PBS和不给予任何注射.观察活体眼部组织EGFP表达情况及阳性细胞的类型.结果 低浓度注射组在各个时间点眼表均未观察到EGFP荧光表达.高浓度注射组在注射病毒第1 d即可以观察EGFP的表达,在第10 d时眼表EGFP荧光亮度、范围增加为明显.EGFP在角膜内皮细胞、虹膜色素上皮细胞及小梁网阳性表达.结论 Ad5型腺病毒载体定向携带报告基因在眼前节表达,为眼前节疾病的基因治疗提供了实验依据.
关键词： 复制缺陷型腺病毒载体 基因治疗 角膜内皮细胞 报告基因 -
负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响
目的 探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达.方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达.结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调.结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平.
关键词： RNA指导的DNA聚合酶 胃肿瘤 复制缺陷型腺病毒载体 -
负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定
目的 包装负载人miR-29a前体全长cDNA(pre-miR-29a)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR29a).方法 将pre-miR-29a全基因合成后,插入腺病毒穿梭质粒pDC315,与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1、3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装重组慢病毒Ad-miR29a,扩增、收集并纯化.对纯化后的Ad-miR29a进行滴度测定、感染性鉴定及PCR鉴定.结果 包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5 x 109pfu/ml.PCR鉴定Ad-miR29a可扩增出pre-miR-29a特异片段,而对照Ad-LacZ不能扩增出pre-miR-29a特异片段.Ad-miR29a感染人胃癌SGC-7901细胞后,可明显提高miR-29a的表达丰度.结论 成功包装了负载miR-29a的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究microRNAs在肿瘤发生发展中的作用,以及miR-29a在肿瘤治疗中的价值奠定了基础.
