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酒精性心肌病小鼠心电图校正QT间期延长的电生理机制探讨
目的：通过建立酒精性心肌病小鼠动物模型，研究酒精性心肌病小鼠校正QT间期（QTc）延长的电生理机制。
方法：将40只C57 BL/6小鼠随机分为两组，酒精组（n=25）和对照组（n=15）。酒精组通过长期饮酒和灌胃建立小鼠酒精性心肌病模型，因造模和麻醉过程中死亡12只小鼠，终纳入13只小鼠，对照组麻醉过程中死亡3只小鼠，终纳入12只。使用染色和电镜验证酒精性心肌病模型，用小动物心电图测量小鼠心电图相关指标，通过酶解法将小鼠心室肌细胞进行急性分离，后使用全细胞膜片钳技术对细胞动作电位以及各种离子通道进行电生理学检测，并进行通道相关动力学急性检测。
结果：5个月后，酒精组小鼠平均左心室射血分数（LVEF）值为（39.06±1.511）%，而对照组小鼠为（61.18±2.56）%。小鼠心电图检查显示，酒精组平均QTc较对照组明显延长[（106.43±5.91）ms vs（85.64±6.35）ms，P<0.05]。全细胞膜片钳实验发现，酒精组小鼠心肌细胞动作电位时程延长，心肌细胞动作电位复极至90%所需时间（APD90）为（37.62±3.53）ms，对照组小鼠心肌细胞APD90为（25.77±3.41）ms。膜片钳实验发现酒精组小鼠L型钙电流失活延迟，其窗口电流面积增大。
结论：长期大量饮酒可导致心室肌钙通道失活延迟，从而延长心室肌细胞动作电位。这是酒精性心肌病小鼠心电图QTc延长的原因之一。 -
膜片钳实验中的电极内气动微压力控制系统
在膜片钳实验中,吉欧封接的形成一般是通过控制电极内压力来实现的.电极入液时,首先需稍加一微小正压使电极内液稍外流,以避免因细胞浴液倒吸入电极而造成玻璃微电极尖端污染;然后需给电极尖端施加一定的负压来实现电极与细胞膜的吸附,进而实现高阻封接(吉欧封接).我们开发了应用于膜片钳实验的气动微压力控制系统,并实际应用到实验中实现细胞的吉欧封接.
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钙激活钾通道参与重症失血性体克大鼠肠系膜细动脉平滑肌细胞膜的超极化
目的：血压降低、血管反应性低下是导致创伤、脓毒性等休克病 人死亡的重要原因之一。我 室曾提出了致血管反应性降低的细胞膜超极化理论，并报道了ATP敏感钾通道在血管反应性 低下中的作用：认为随着休克的发展，组织细胞缺血、缺氧加重，ATP耗竭，细胞内乳酸堆 积，从而激活了ATP敏感钾通道，使细胞膜超极化，血管舒张。除ATP敏感钾通道外，在微动 脉平滑肌细胞中还有两种钾通道，即：内向整流钾通道(Kir)和钙激活钾通道(Kca)。 其中钙激活钾通道(Kca)在血管平滑肌细胞上尤其丰富，而且在血管平滑肌细胞的肌 源性调节中起着重 要的作用。本文目的在于进一步阐明钙激活钾通道在休克大鼠肠系膜细动脉平滑肌细胞膜超 极化中的作用，从而为临床治疗提供理论基础。 方法：实验用Wistar大鼠，雌雄兼有，体重200+10 g。大鼠以13.3％乌拉坦＋0. 5 %氯醛糖肌肉麻醉，双侧股动脉插管，一侧用于测量血压，另侧用于放血，血压维持在38-40 mmHg 2 h，复制失血性休克大鼠模型。对照组只做手术，不放血。手术毕的动物放血除死 ，立即取 肠系膜动脉置于0℃的HPSS(mmol/L：NaCl l30，KCl 5，CaCl2 l.5，MgCl2 l.2，HEP ES l0，G1ucose l0，pH 7.2-7.4)液中，小心剥去周围脂肪组织，分离出肠系膜A2、A3 动脉(直径约 80-150 μm)，平衡30 min后，用1 g／L Pronase E 37 ℃温浴消化15-30 min，机械吹 打出单个平 滑肌细胞。细胞悬液滴入17 mm×17 mm的盖玻片上，细胞贴壁后，将盛有细胞的盖玻片用浴 槽液 冲洗后放入浴槽中，选用舒张态、边缘清晰的细胞进行膜片钳实验。膜片钳实验采用细胞贴 附式和内面向外式的单通道电流记录法。电极液成分为mmol/L：KCl l40，MgCl2 l.0， HE PES l0，EGTA 0.5，CdCl2 0.3，pH7.2-7.4，根据需要加入不同的CaCl2以调节自 由Ca 2+浓度；浴槽液用生理的HPSS液。由于电极液与细胞内液无K+浓度梯度，而浴槽液为 生理溶液，根据公 式I＝g(Vm-Vp)(其中I为单通道电流，g为电导，Vp为电极电压，Vm为静息膜电位)，用细胞 贴附式记录时，当电流为零时，Vp等于Vm，即可通过所给予的电极电压算出细胞的膜电位。 实验采用的电极电阻为8-10 MΩ，封接电阻大于2 GΩ，放大器(CEZ-2400，NIHON KOHDEN ， 日本)探头反馈电阻为50 G，低通滤波频率为2 kHz，实验数据记录和分析用Pclamp7.0(A xon ，美国)。结果：1.Kca通道的鉴定：实验记录的通道具有电压依 赖性、高度的K+选择性、对胞外TEA 的敏感性和胞内Ca2+浓度的依赖性，据此可以鉴定实验中所记录的通道为钙激活钾通 道。2. Kca通道的变化与休克后细胞膜电位超极化：对照组(n＝7)的I-Vp曲线 方程式 为I＝0.073Vp+2.8528；而休克组(n=8)为I=0.058Vp+4.5672，由此算出正常组肠系 膜平 滑肌细胞膜电位为-39.0 mV，休克组为-78.4 mV。静息(钳制电压为零)时，休克组KC a通道电流(3.36±l.17 pA)明显高于对照组(2.27±l.86 pA)。结论和讨论：由以上实验结果可以得出：1.在重症失血性休克时，大鼠肠 系膜细动脉平滑肌细胞膜发生了超极化：2.Kca通道参与了休克时细胞膜的超极化 。 测量膜电位的方法有多种，如细胞内直接记录法、荧光标记法等。曾有报道在脓毒性休 克和失血性休克时动脉平滑肌细胞膜发生了超极化，我室前期工作也证明失血性休克大鼠肠 系膜平滑肌细胞膜发生了超极化，但对于超极化产生的直接原因一直没有阐明。本文采用的 膜电位记录法不仅阐明了休克后细胞膜电位产生了超极化，从而引起血管平滑肌反应性降低 ，同时也证明，Kca在休克后膜电位的变化中起着一定的作用。
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大鼠肺内动脉平滑肌细胞分离及穿孔膜片钳记录
目的:肺动脉平滑肌细胞钾离子通道活性与缺氧性肺动脉高压关系是近年研究热点,改变这些钾离子通道活性能直接影响血管张力.缺氧可阻断延迟整流性钾通道或/和钙离子激活性钾通道,引起肺动脉平滑肌细胞收缩,使肺动脉压升高.目前,国内有关肺动脉平滑肌细胞钾离子通道活性与缺氧性肺动脉高压关系的研究还很初浅,主要与肺动脉平滑肌细胞的急性分离以及膜片钳实验时细胞封接、破膜十分困难有关.大鼠肺内动脉平滑肌细胞电生理研究尚无报道,原因与其细胞分离困难更大有关.方法和结果:利用胶原酶、木瓜蛋白酶酶解消化的方法,成功地急性分离出大鼠肺内动脉平滑肌细胞,发现分离的细胞具有较高的成活率,呈舒展长梭形,边界清晰、有完整的胞膜、胞浆均匀,高倍镜下可见清晰的细胞核.细胞对苯肾上腺素有剂量依耐性收缩反应,免疫组化显示胞浆内表达细丝状的平滑肌α-actin.分离的细胞较易封接,用二性霉素B较易穿孔、破膜并记录到全细胞钾电流.结论:大鼠肺内动脉平滑肌细胞急性分离及全细胞穿孔膜片钳方法的建立,为HPV的研究提供了极其重要的实验方法.
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豚鼠心肌细胞急性酶分离方法
用于膜片钳实验的细胞必须具备细胞膜完整、表面光洁、活性良好.这类细胞既可以通过原代培养方式获得,也可通过急性酶分离方法获得.细胞情况如何是膜片钳实验是否成功的第一个关键性步骤.本研究总结多年的经验摸索出一套行之有效的豚鼠心肌细胞分离方法,具体步骤如下:
