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类风湿关节炎患者血清神经轴突导向分子Semaphorin5A表达及其对破骨细胞分化的影响
目的 研究类风湿关节炎(RA)患者血清神经轴突导向分子Semaphorin 5A (Sema 5A)表达及其对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化的作用.方法 (1)选RA患者62例,骨关节炎(OA)患者30例,健康对照者48例,应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测所有受试者血清Sema5A水平.(2)以不同浓度Sema 5A(0、0.5、1、2.5、5μg/ml)处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,培养7d后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测TRAP、组织蛋白酶-K、基质金属蛋白酶-9 mRNA表达水平;(3)以5μg/ml Sema 5A处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞7d,培养基中预先加入薄骨片,显微镜下观察骨吸收陷窝个数.结果 (1)RA患者血清Sema 5A水平显著高于健康对照者和OA患者[(5.24±0.59) μg/L比(2.93±0.34)μg/L比(2.68±0.47)μg/L,P＜0.05)];抗环瓜氨酸多肽(CCP)抗体阳性RA患者血清Sema 5A水平显著高于抗CCP抗体阴性者(P＜0.05).Sema 5A水平与RA患者以C反应蛋白计算的28个关节疾病活动度(DAS28-CRP)、C反应蛋白、临床疾病活动指数(CDAI)、Sharp评分呈正相关(r值分别为0.273、0.519、0.448、0.292,P＜0.05);(2)随着Sema 5A浓度增加,TRAP染色阳性细胞数逐渐增多,5μg/ml Sema 5A作用强.Sema5A能诱导TRAP、组织蛋白酶-K、基质金属蛋白酶-9mRNA表达上调;(3)与空白比,5μg/ml Sema 5A骨吸收陷窝数增多.结论 RA患者血清Sema 5A水平显著升高,与患者的疾病活动度及骨破坏程度相关.Sema 5A可直接诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化.
关键词： 关节炎 类风湿 Semaphorin 5A 破骨细胞 -
shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响
目的：探讨慢病毒介导短发夹RNA（shRNA）沉默神经导向分子5A（Semaphorin 5A）基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物，构建慢病毒载体，转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒，利用慢病毒感染A?375细胞系并通过嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染细胞系，实验分为实验组细胞（A375?shRNA1和A375?shRNA2）、阴性对照组细胞（A375?con）及空白对照组细胞（A375）。通过反转录PCR（RT?PCR）、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况；侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。结果 Semaphorin 5A成功转染A375细胞后，经嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染实验组A375?shRNA2细胞系及对照组A375?con。反转录PCR及Western印迹检测，干扰后实验组A375?shRNA2较对照组A375?con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示，A375?con与A375细胞生长差异无统计学意义（P>0.05），A375?shRNA2细胞生长明显减慢，与A375和A375?con比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。划痕实验结果显示，A375?shRNA2划痕处细胞无明显迁移，划痕未得到修复，而A375及A375?con划痕处细胞终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示，A375组与A375?con组穿过的细胞数差异无统计学意义（P>0.05）；而A375?shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375?con组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375中的Semaphorin 5A有效下调，并抑制细胞的生长，降低细胞的侵袭以及运动能力。
