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显性负效应在胰岛素基因突变所致青少年型糖尿病中的作用
目的 探讨显性负效应(指由于基因突变导致突变型蛋白自身无生理功能且影响另一正常蛋白发挥生理功能的一种干涉现象)在不同类型胰岛素基因突变所致青少年型糖尿病(MIDY)发病机制中的作用.方法 观察3个与MIDY相关的突变型前胰岛素原C(A7)Y、G(B8)S、R(SP6)H对共存的野生型前胰岛素原分泌的影响,并引入一个含有MIDY相关突变但不能形成二硫键的突变型前胰岛素原-DelCys,共分为7组:分别用含有突变型前胰岛素原cDNA的重组质粒和含有人野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒共转染293T细胞,设为C(A7)Y组、G(B8)S组、R(SP6)H组和DelCys组,将含有人野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒与含有小鼠野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒共转染作为正常对照组,将含有人野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒与pCMS-EGFP质粒共转染作为阳性对照组,用含有小鼠野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒转染293T细胞作为阴性对照组.转染48 h后收集细胞和培养液,采用人特异性胰岛素原放免试剂盒检测细胞内和培养液中人胰岛素原水平.统计学分析采用单因素方差分析及t检验.结果 比较细胞内人胰岛素原水平,各组间差异无统计学意义(F=0.58,P>0.05).比较细胞培养液中人胰岛素原水平,各组间差异有统计学意义(F=297.57,P<0.01).与正常对照组相比,C(A7)Y组和G(B8)S组细胞培养液中人胰岛素原水平明显降低[分别为(135.84±1.89)比(29.28±6.85)、(33.62±10.52)pmol/L,t=22.58、21.66,均P<0.01],R(SP6)H组和DelCys组与正常对照组相比差异无统计学意义(t=0.00、0.39,均P>0.05).结论 与MIDY相关的突变型胰岛素原C(A7)Y和G(B8)S会对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应(表现为抑制其胰岛素原分泌),而R(SP6)H突变不产生显性负效应.产生显性负效应的分子机制可能与分子间异常二硫键的形成有关.
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人胰岛素原基因突变导致糖尿病机制的实验研究
目的:构建几种与人类糖尿病相关的人突变型胰岛素原质粒,并在大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)中进行表达。方法以野生型人胰岛素原质粒基因PCMS-EGFP/HWT为模板,设计并合成引物,利用定点突变技术,PCR生成PCMS-EGFP/H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C、H-F(B25)L 4种单点突变质粒,对每个质粒进行序列测定验证定点突变成功,用脂质体2000将上述野生型、4种突变型质粒及空质粒分别转染INS-1细胞,放射免疫法检测各细胞培养液中人胰岛素水平。结果序列测定证实上述质粒定点突变成功, H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C 3组突变细胞培养液中胰岛素水平低于野生型和H-F(B25)L组(P<0.05),与空质粒组差异无统计学意义,且3组彼此间差异无统计学意义;H-F(B25)L组与野生型差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建并表达4种突变型人胰岛素原质粒,不同突变型胰岛素原可能通过不同机制导致糖尿病。